液芯包囊化清酒乳桿菌增殖培養基的優(yōu)化（1）

關(guān)鍵詞：液芯包囊；清酒乳桿菌；乳清粉；增殖培養基；響應曲面法  

直投式發(fā)酵劑加工發(fā)酵乳是當今發(fā)酵乳工業(yè)化生產(chǎn)的發(fā)展方向。發(fā)酵劑的質(zhì)量將直接影響發(fā)

酵乳的品質(zhì)，而高濃度菌體的獲得又是研制高效濃縮型發(fā)酵劑的關(guān)鍵。傳統的乳酸菌培養采用游離細胞懸浮培養，生產(chǎn)效率低，細胞密度低， 細胞分離難，成本高。 包囊化乳酸菌避免了傳統發(fā)酵劑的缺點(diǎn)和限制，細胞密度可達到10¹⁰ cfu／g以上，從培養基中分離細胞不需經(jīng)過(guò)超濾或冷凍離心，而用普通的過(guò)濾就可進(jìn)行，因此大大降低了生產(chǎn)成本。無(wú)論采用何種技術(shù)和方式來(lái)生產(chǎn)高效濃縮型直投式發(fā)酵劑，都必須首先獲得使乳酸菌能夠大量生長(cháng)的增菌培養基。適合工業(yè)化生產(chǎn)的乳酸菌培養基必須基于原料易得、 價(jià)格低廉、 菌體產(chǎn)量高^［2］。  

乳清是乳品工業(yè)的副產(chǎn)品，主要成分為乳糖，還含有蛋白質(zhì)及無(wú)機鹽等成分。 必需氨基酸、 礦物質(zhì)和B族維生素的含量也較豐富l   3 l 。本研究以乳清粉為基礎培養基，補充適當碳、氮源，促生長(cháng)因子，pH緩沖劑，用于自發(fā)酵肉中分離的清酒乳桿菌包囊化高密度培養。   

1材料與方法

1．1實(shí)驗材料

1．1．1供試菌株

清酒乳桿菌 ( Lactobacillus sake L．S—MA 3一l0)，本實(shí)驗室分離和保藏。   

1．1．2培養基

菌種活化培養基：MRS培養基^［4］。 

活菌計數培養基：MR S培養基。

細胞增殖基礎培養基：乳清粉6％，葡萄糖2％，酵母粉2％，CaCO₃ 0．5％，MgSO₄  0．028％， MnSO₄ 0．005％。 

番茄汁的制備：將新鮮番茄洗凈，切碎，放人三角燒瓶，置4℃冰箱 8一l2h，取出后用紗布過(guò)濾即成。

胡蘿卜汁的制備： 將新鮮胡蘿卜洗凈，切碎，加等量水煮沸 20—30main， 離心收集上清。

1．2實(shí)驗方法

1．2．1液芯包囊的制備^［5,6］ 

將甘油管保存的菌株L．sake 用MRS液體培養基活化兩次，發(fā)酵液離心收集菌體，加入少許生理鹽水懸浮菌泥，再倒入1．5％ (w／v )CaC1₂ 溶液與0．3％(w／v ) 黃原膠溶液的混合液中制成菌懸液。  

將菌懸液置入已滅菌的l0 mL注射針筒中，逐滴滴入磁力攪拌的0．8％ (w／v) 海藻酸鈉溶液中(含 0．1％吐溫一80)， 所形成的液芯包囊過(guò)濾后用生理鹽水洗滌， 轉移到2％ (w／v)CaC1₂溶液中硬化處理1h，然后將過(guò)濾并用生理鹽水洗滌過(guò)的包囊置于0．3％(w ／v ) 殼聚糖溶液中，在定軌搖床上輕微搖30min，最后生理鹽水洗滌，收集包囊。 

1．2．2液芯包囊清酒乳桿菌的增殖培養

按實(shí)驗設計 配制培養基，108滅菌 2 0mi n，冷卻后，以l％(w／v )的固定化包囊接種， 置搖床內，轉速為80r／min，37℃培養20h后，過(guò)濾進(jìn)行包囊內細胞計數。   

1．2．3囊內細胞計數用^［7］ 

無(wú)菌稱(chēng)取1g包囊，放入99mL滅菌的檸檬酸鈉溶液中(1％( w／v )，pH 6．0)，待包囊完全溶解后，用無(wú)菌生理鹽水逐級稀釋后進(jìn)行平板計數。 

1．3實(shí)驗設計

1．3．1單因素實(shí)驗設計

將不同的碳源、 氮源、 促生長(cháng)因子及不同濃度的pH緩沖劑CaCO₃分別添加到培養基中，按1％的接種量放入包囊化清酒乳桿菌，調節起始pH，在一定溫度下培養一定的時(shí)間，進(jìn)行囊內細胞計數。  

1．3．2響應曲面實(shí)驗設計

在單因素試驗基礎上，確定包囊化清酒乳桿菌增殖的生長(cháng)強化因子，采用響應面分析尋求多因素系統中培養基組分的最佳優(yōu)化條件。      

本實(shí)驗采用旋轉中心組合設計（Central Composite Rotatable Design， CCRD ) 法， 選擇葡萄糖、蛋白胨、番茄汁以及CaCO₃ 四個(gè)因子為研究對象，以菌體濃度為響應值，設計試驗，對實(shí)驗數據進(jìn)行二次回歸擬合，得到包括一次項、平方項和交互項的二次方程，分析各因素的主效應和交互效應，最后在一定水平范圍內求取最佳值。

本階段實(shí)驗輔助軟件為Design Expert 軟件(Version6．0．10，Stat - Ease．，Minneapolis，MN．USA)。實(shí)際考察的變量及其實(shí)驗編碼見(jiàn)表1。

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