真菌染色新方法的探索

　　［關(guān)鍵詞］ 真菌菌種；蓋玻片；棉蘭染色液

　　真菌的種類(lèi)很多，在自然界分布極廣，它的形態(tài)結構復雜，菌絲體和孢子的形態(tài)特征隨真菌種類(lèi)不同而異，是鑒別真菌的重要依據。傳統的真菌染色方法，常常造成真菌孢子脫落，從而改變了它原有的形態(tài)構造，影響觀(guān)察、鑒定［1］。我們經(jīng)多次反復摸索，利用真菌菌絲體呈上聳向空間生長(cháng)特征，用插片法使菌絲體生長(cháng)在蓋玻片上，這樣制作的真菌染色片效果更為理想，在以往的文獻中還未見(jiàn)報道�，F將本方法報道如下。

　　1  材料與方法

　　1．1  菌種 

　　青霉菌、黑曲菌、黃曲菌、毛霉菌、石膏樣小孢子菌、絮狀表皮癬菌等，以上菌種均為本實(shí)驗室保存提供。

　　1．2  染液的配制染液 

　　苯酚(結晶品)20 g，乳酸20 ml，甘油40 ml，棉蘭(Cotton blue)0．05 g，蒸餾水20 ml，將苯酚、乳酸、甘油溶解于蒸餾水中(可微加熱)，再加入棉蘭，搖勻，備用。

　　1．3  沙氏培養基的制備

　　蛋白胨10 g，葡萄糖40 g，瓊脂1 g，蒸餾水1 000 ml，68.95 kPa，20 min，備用［2］。

　　1．4  方法

　　1．4．1  設試驗組與對照組兩組，各染片100張。試驗組即改良的真菌染色法［4］，將沙氏培養基傾注大平板，取無(wú)菌蓋玻片沾上融化的沙氏培養基，密集豎立插在大平板上，將上述菌種用滅菌蒸餾水輕輕刮下，滴在大平板上，并輕輕搖動(dòng)，使之均勻分布于平板表面，蓋上平板蓋，于25 ℃～28 ℃濕盒孵育，72 h取出后，用鑷子輕輕取出蓋玻片，用火焰固定或自然晾干后，滴上棉蘭染色液，2 h~3 h后，于水中輕柔漂洗，然后晾干，放載玻片上封片。對照組即傳統的真菌染色法，在無(wú)菌載玻片上滴加融化的沙氏培養基1滴~2滴，將菌種接種在沙氏培養基上，加蓋無(wú)菌蓋玻片，于25 ℃～28 ℃濕盒孵育，72 h取出后，揭開(kāi)蓋玻片，滴加染液，使真菌培養物與棉蘭染液混合染色［3］。

    4．2  染色效果評判標準 

　　優(yōu)片：鏡下觀(guān)察可見(jiàn)真菌菌絲體和孢子形態(tài)保持自然完整，孢子基本沒(méi)有脫落，底影干凈、清晰；良片：在鏡下觀(guān)察可見(jiàn)大部分菌絲與孢子形態(tài)較為完整、有少許脫落、底影較臟；差片：在鏡下觀(guān)察可見(jiàn)孢子與菌絲分離、脫落、底影臟，形態(tài)不完整。

　　2  結果

　　試驗組：染片100張屬優(yōu)片有80張，良片有10張，差片有10張；對照組：染片100張屬優(yōu)片有10張，良片有10張，差片有80張。兩組優(yōu)片率比較差異有統計學(xué)意義(P<0.01)。

　　3  討論

　　兩種不同染色方法的結果比較，可以看出制片效果有以下明顯差異：傳統法由于菌種接種在載玻片瓊脂培養，棉蘭液染色時(shí)，染料掛有瓊脂，鏡下可見(jiàn)底影臟，影響檢測效果；改良法是直接滴加棉蘭染液在蓋玻片上進(jìn)行染色，這樣有效減少雜質(zhì)的干擾，提高底影潔凈度，鏡下可見(jiàn)干凈、清晰；傳統法掀開(kāi)蓋玻片，容易使孢子與菌絲分離、脫落；改良法是利用真菌菌絲體和孢子向上生長(cháng)構造，菌絲體和孢子生長(cháng)在蓋玻片上，使真菌形態(tài)保持自然完整。我們經(jīng)多次反復實(shí)踐證明，本法簡(jiǎn)單、易掌握，效果好并適合大批量快速制片，不失為一種真菌染色的新方法。

　　參考文獻：

　�。�1］張子康，何光澤，等．醫學(xué)微生物學(xué)與免疫學(xué)實(shí)驗教程［M］.第1版．四川：四川科學(xué)技術(shù)出版社，1989：7．

　�。�2］陸德源.醫學(xué)微生物學(xué)［M］.第5版.北京：人民衛生出版社，2002，11(5).

　�。�3］凌啟波，梁英杰．常見(jiàn)真菌的形態(tài)學(xué)特征和常用染色方法［J］．臨床與實(shí)驗病理學(xué)雜志，2003，10：19．

　�。�4］陳倪勇，肖永波．介紹一種真菌的方法［J］.中華病理學(xué)雜志，2001，10．

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