癌癥是嚴重影響人類(lèi)健康的重大疾病之一，是僅次于心臟病的第二大死因川。美國國家癌癥協(xié)會(huì )(NIC)預測，在今后的10～15年內，紫杉醇將成為主要的抗癌藥物 。紫杉醇作為臨床新藥，最初是由美國的化學(xué)家Wani 于1971年從美國西部大森林中稱(chēng)為太平洋紫杉(T.brevifolia)的樹(shù)皮中提取出來(lái)的。1979年美國癌癥中心(NauonalCancer Institute)iiE實(shí)紫杉醇有獨特的抗癌機理，1983年開(kāi)始進(jìn)入臨床試驗。1992年美國食品和藥物管理局(FDA)批準紫杉醇作為治療轉移性卵巢癌的新藥上市，1994年又批準該藥用于治療轉移性乳腺癌。目前用于肺癌、結腸癌、支氣管癌等的臨床試驗也有望成功 。但是，制備一例病人所需藥物要用3～4棵百年的老紫杉樹(shù)，而從大約2 000棵稀有的紫杉樹(shù)皮中只能提取1 kg紫杉醇，并且美國環(huán)境保護者正試圖將此樹(shù)列入瀕危樹(shù)種。因此說(shuō)，紫杉醇的大量臨床應用必將靠生物工程，尤其是微生物發(fā)酵。發(fā)酵工程能為具有巨大潛在價(jià)值的新物種創(chuàng )造良好的生長(cháng)、繁殖條件，并能進(jìn)行大規模的培養，充分發(fā)揮其內在潛力。由于發(fā)酵工程具有顯著(zhù)的經(jīng)濟效益、社會(huì )效益和生態(tài)效益，它將對各領(lǐng)域生產(chǎn)發(fā)展作出越來(lái)越大的貢獻。在附生于紅豆杉樹(shù)皮的真菌發(fā)酵液中發(fā)現含有紫杉醇，是近年紫杉醇資源研究的重要成就。環(huán)境形成的生態(tài)復合體以及與此相關(guān)的各種生態(tài)過(guò)程的總合，包括數以百萬(wàn)計的動(dòng)植物、微生物和它們生物多樣性是地球上生命經(jīng)過(guò)幾十億年進(jìn)化發(fā)展的結果。一般為人們所接受的生物多樣性概念是指生物及其與所擁有的基因以及它們與環(huán)境問(wèn)形成的復雜的生態(tài)系統。生物多樣性?xún)群謴V泛，是地球最顯著(zhù)的特征之一 。結合內生真菌的特點(diǎn)，以下主要簡(jiǎn)述紫杉醇產(chǎn)生菌在來(lái)源和物種方面的生物多樣性及對生態(tài)系統的重要意義。
1 紫杉醇產(chǎn)生菌的生物多樣性
1993年，美國化學(xué)家Stierle和植物病理學(xué)家Strobe1從短葉紅豆杉(Taxus.brevifolia)的韌皮部分離到一株產(chǎn)紫杉醇的內生真菌(endophyfic fun—gi) 。通過(guò)采用質(zhì)譜、色譜(TLC/HPLC)和放射性化學(xué)標記等方法，證明分離到的菌的3周培養物中存在紫杉醇及其類(lèi)似物，含量為24～50μg/L。盡管含量低，但為開(kāi)發(fā)紫杉醇來(lái)源提供了一條新的途徑，也使真菌學(xué)得到了更大的促進(jìn)和發(fā)展。
1.1 紫杉醇產(chǎn)生菌宿主的多樣性
根據真菌產(chǎn)生赤霉素和植物產(chǎn)生赤霉素有著(zhù)共同的生理途徑和活性這一原理，1996年，Strobel等 從西藏紅豆杉(T.wallachiana)的小枝中分離到可產(chǎn)紫杉醇的內生真菌。將此真菌置于MID培養液中，23 ℃靜置2～3周，培養液中的紫杉醇含量可達到峰值，為6o～70 μg/L。在紅豆杉樹(shù)以外的樹(shù)種中，研究人員也分離到可產(chǎn)紫杉醇的內生真菌。另外，Strobel等 從一種松樹(shù)(Wollemianobilis)中分離到一株產(chǎn)紫杉醇的內生真菌;li等從禿柏(Taxodium distichum)的樹(shù)皮、韌皮部和木質(zhì)部中都分離出產(chǎn)紫杉醇的內生真菌。而其它樹(shù)種是否也能分離出產(chǎn)紫杉醇的內生真菌，還有待研究。
1.2 紫杉醇產(chǎn)生菌的生態(tài)多樣性
自1993年Stierle等 從太平洋紅豆杉的韌皮部中分離得到產(chǎn)紫杉醇的內生真菌以來(lái)，隨后在歐亞大陸也分離到產(chǎn)紫杉醇的內生真菌，如邱德有等從云南紅豆杉 (T.yunnanens/s)的樹(shù)皮中分離出一株可產(chǎn)紫杉醇的內生真菌。張理珉等 從云南紅豆杉樹(shù)皮中分離出一株可產(chǎn)紫杉醇的內生真菌。馬天有等 從中國紅豆杉(T.c—hinesis)樹(shù)皮中分離得到一株內生真菌，能產(chǎn)紫杉醇，產(chǎn)量為14.20 μg /L。王偉等¨ 從中國紅豆杉南方變種(T.chinensis var.mairei)中分離得到6株能產(chǎn)紫杉醇及其類(lèi)似物的內生真菌。王建峰等 也從南方紅豆杉皮層中分離到一株紫杉醇產(chǎn)生菌，發(fā)酵產(chǎn)物紫杉醇含量為185.4 t,g/L。1993年，周東坡等 從百年以上的東北紅豆杉(T.cuspidata)的枝條與樹(shù)皮中分離到3株可產(chǎn)紫杉醇的內生真菌，后來(lái)又分離到1株。發(fā)酵液中紫杉醇的產(chǎn)量可達 51.06～125.70 L。2003年，陳毅堅等¨ 又從云南紅豆杉(T.yunnanens/s)中分離得到8株紫杉醇的內生真菌，其中TAX-47、TAX -49的紫杉醇獲得率分別為47.302μg /L和31.060 μg /L。
紫杉醇產(chǎn)生菌的宿主多見(jiàn)于裸子植物紅豆杉科(Taxaceae)的紅豆杉屬(Taxus)和澳洲紅豆杉屬(Austrotaxus)中。前者廣泛分布于歐亞大陸和北美，如中國的東北三省、中原地區、云南、貴州、四川、西藏以及美國和加拿大等地區;在寒帶、溫帶及亞熱帶地區也有分布，但分布星散，極少成林，且生長(cháng)緩慢。后者僅見(jiàn)于南半球，數量極少。紅豆杉屬(Taxus)植物為紅豆杉科長(cháng)綠喬木或灌木，全世界約有11種，我國有其中的4種1變種，即西藏紅豆杉、東北紅豆杉、云南紅豆杉、中國紅豆杉和南方紅豆杉。到目前為止，從這幾種紅豆杉中都已分離到紫杉醇產(chǎn)生菌。另有報道，從美國的短葉紅豆杉(T.brevifolia Nutt.)中也分離出了產(chǎn)紫杉醇的內生真菌。至今已有數十株產(chǎn)紫杉醇的內生真菌問(wèn)世，充分證明其具有生態(tài)多樣性 。
另外，真菌是地球上尚待深入研究的最重要的有機體之一。自然界的真菌有數千種小生境，包括與更大的真菌或高等植物共生。內生真菌是指那些在其生活史中的某一段時(shí)期生活在植物組織內，且對植物組織沒(méi)有引起明顯病害癥狀的菌。任何與紅豆杉屬植物存在物質(zhì)、能量交換的生物都有可能出現紫杉醇的遺傳基因傳遞，尤其是附生菌類(lèi)最可能。研究表明，紅豆杉中的紫杉醇含量與其種屬無(wú)明顯的相關(guān)性，而與紅豆杉的產(chǎn)地生態(tài)環(huán)境密切相關(guān)。所以人們有待于從和紅豆杉有相同環(huán)境要求的其他植物中分離出更多的紫杉醇產(chǎn)生菌，而且紅豆杉樹(shù)的主干和側枝、枝條的樹(shù)皮、韌皮部以及皮下部分、根、成熟莖、果實(shí)及葉子中的內生真菌的研究已有報道。
1.3 紫杉醇產(chǎn)生菌的物種多樣性
物種即生物種，是生物進(jìn)化鏈索上的基本環(huán)節，它雖然處于不斷變異與不斷發(fā)展之中，但同時(shí)也是相對穩定的。據估計現存真菌數為150萬(wàn)種。真菌種類(lèi)如此豐富，紫杉醇產(chǎn)生菌雖處于研究的初始階段，但已證明具有豐富的物種多樣性 副(見(jiàn)表1)。
另外，張理珉等 從云南紅豆杉樹(shù)皮中分離出80多株內生真菌，并從中篩選出了3株，即Microsphaeropsis onychiuri、Mucor sp. 和Ahernarianhernata�？梢�(jiàn)分離出的這些菌株90% 以上都具有自己的種屬特異性，其中有2株即Taxomycesnndrennon和Nodulisporium sylvifo丌ne是新記錄種，且后者是新記錄屬。1996年從西藏紅豆杉中分離到一株產(chǎn)紫杉醇的內生真菌小孢盤(pán)多拉毛霉。用免疫學(xué)方法篩選，發(fā)現不少太平洋紅豆杉內生真菌，如青霉、盤(pán)多拉毛霉、鏈孢霉、交鏈孢霉、鼓孢瘤座霉、盤(pán)單毛孢霉等都能產(chǎn)紫杉醇 �？傊�，產(chǎn)紫杉醇植物內生真菌具有豐富的物種多樣性。但目前發(fā)現的種類(lèi)少、數量小、產(chǎn)量低，還有待于研究人員進(jìn)一步從紅豆杉的各個(gè)部位，乃至其他植物中分離更多產(chǎn)量更高的內生真菌。
2 紫杉醇產(chǎn)生菌的生物多樣性意義
紫杉醇在紅豆杉屬植物樹(shù)皮中的含量約為0.01% ，每提取1 kg紫杉醇，要砍伐大約2 000棵樹(shù)，即便將全部天然資源采伐，也只能滿(mǎn)足短期需要，且造成對森林和人類(lèi)生存環(huán)境以及生物多樣性不可彌補的損失。因此，紫杉醇的原料保障就成為該藥能否成功走向市場(chǎng)的關(guān)鍵因素。紫杉醇內生真菌的分離是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的一種有效解決紫杉醇資源問(wèn)題的新途徑。
3 真菌發(fā)酵生產(chǎn)紫杉醇的應用前景
真菌發(fā)酵生產(chǎn)紫杉醇進(jìn)入商業(yè)化、產(chǎn)業(yè)化的條件：① 良種選育是基礎，必須選育優(yōu)質(zhì)的高產(chǎn)菌株;② 以現代生物技術(shù)提升紫杉醇產(chǎn)生菌的潛力。目前發(fā)現的菌株產(chǎn)量最高為185.4μg /L，未能達到大規模工業(yè)化生產(chǎn)的要求。因此仍然需要解決若干技術(shù)關(guān)鍵�？上驳氖且灾軚|坡教授為首的研究小組1993年從東北紅豆杉樹(shù)皮中分離到3株可產(chǎn)紫杉醇的內生真菌，即HQDs 、HQDa 和HQD “ 。經(jīng)形態(tài)學(xué)鑒定HQD 為側孢座腔菌屬(Pleurocytospora taxi)，HD為鏈格孢屬(AlternariaTaxi)(葛箐平等，2003，待發(fā)表)，而HQD弱和HQDa為樹(shù)狀多節孢 (Nodulisporium sylvifome)，是我國一新記錄屬，新記錄種 �，F已對HQD 進(jìn)行了原生質(zhì)體誘變、雙親滅活原生質(zhì)體融合，構建了紫杉醇產(chǎn)生菌的工程菌株TPF—I，產(chǎn)量由原來(lái)的51.06～125.70μg/L提高N448.52μg/L，并進(jìn)行了 2.8 L和10 L發(fā)酵罐發(fā)酵工藝試驗，結果表明，發(fā)酵液中紫杉醇含量達406.95μg/L和395.12 ttg/L(平均值)，且產(chǎn)量穩定。在今后幾年內，我們將對菌株不斷地進(jìn)行選育提高，同時(shí)進(jìn)行中間試驗和生產(chǎn)試驗，以期實(shí)現工業(yè)化生產(chǎn)。
上一篇：真菌感染157株藥敏試驗結果分析（2）
下一篇：真菌染色新方法的探索
海博微信公眾號
海博天貓旗艦店
