用氯化鈣制備新鮮的大腸桿菌感受態(tài)細胞

下面的簡(jiǎn)單方案是Clhen等（1972）所用方法的變通方案，常用于成批制備感受態(tài)細菌，這些細菌可使每微克螺旋質(zhì)粒ＤＮＡ產(chǎn)生5x106-2x107個(gè)轉化菌落，這樣的轉化效率足以滿(mǎn)足所有在質(zhì)粒中進(jìn)行的常規克隆的需要。該方法完全適用于大多數大腸桿菌菌株，并且比方案Ｉ快速，重復性更好。該法制備的感受態(tài)細胞可貯存于-70℃，但保存時(shí)間過(guò)長(cháng)會(huì )使轉化效率在一定程度上受到影響。

1、從于37℃培養16-20小時(shí)的新鮮平板中挑取一個(gè)單菌落（直徑２－３mm），轉到一個(gè)含有100ml LB或SOB培養基的1L燒瓶中。于37℃劇烈振搖培養約３小時(shí)（旋轉搖床，300轉/分）。為得到有效轉化，活細胞數不應超過(guò)108細胞ml，可每隔20-30分種測量OD600值來(lái)監測培養物的生長(cháng)情況。在菌株與菌株之間，ＯＤ600值和每毫升中活細胞數間的關(guān)系變化很大，因此有必要通過(guò)測量特定大腸桿菌菌株的生長(cháng)增減物在生長(cháng)周期的不同時(shí)相的ＯＤ600值，并將各黧度的增減物鋪于無(wú)抗生素的ＬＢ瓊脂平皿以計算每一時(shí)相的活細胞數，從而使分光光度讀數得到標化。

2、在無(wú)菌條件下將細菌轉移到一個(gè)無(wú)菌、一次性使用的、用冰預冷的50ml聚丙烯管（Falcon 2070）中，在冰上放置10分鐘，使培養物冷卻至０℃。切記：下述所有步驟均需無(wú)菌操作。

3、于４℃用Sorvall GS3轉頭（或與其相當的轉頭）以4000轉/分離心10分鐘，以回收細胞。

4、倒出培養液，將管倒置１分釧以使最后殘留的痕量培養液流盡。

5、以10ml用冰預冷的0.1mol/L CaCl2重懸每份沉淀，放置于冰浴上。我們發(fā)現將１mol/L CaCl2貯存液[用純水（Ｍille-Q級或與其相當的級別）配制]以10ml小份貯存于-20℃煞是方便。制備感受態(tài)細胞時(shí)，取一小份融化，用純水稀釋至100mlk，用Nalgene濾器（0.45μm孔徑）過(guò)濾除菌，然后驟冷到０℃即可。對于大多數大腸肝菌菌株（除ＭＣ1061外），在這一步采用TFB（見(jiàn)表1.3）代替氯化鈣可得到相同的或更好的結果。

6、于４℃以4000轉/分離心10分鐘，以回收細胞。

7、倒出培養液，將管倒置１分鐘以使最后殘留的痕量培養液流盡。

8、每50ml初始培養物用2ml用冰預冷的0.1mol/L CaCl2[或ＴＦＢ，見(jiàn)表1.3和步驟５）注]重懸每份細胞沉淀。此時(shí)，可將細胞分成小份，放于-70℃凍存[有關(guān)討論請參見(jiàn)53頁(yè)本節（二）步驟11)b.c)]。在這些條件下，盡管長(cháng)期保存后轉化效率會(huì )稍有下降，但細胞仍可保持處于感受態(tài)。Dagert和Ehrlich(1979)曾表明細胞可以于４℃在CaCl2溶液中保存24-48小時(shí)，在貯存的最初12-24小時(shí)內，轉化效率增加３－５倍，然后降低到初始水平。

9、用冷卻的無(wú)菌吸頭從每種感受態(tài)細胞懸液中各取200μl轉移到無(wú)菌的微量離心管中，每管加ＤＮＡ（體積∞10μl,ＤＮＡ∞50ng），輕輕旋轉以混勻內容物，在冰中放置30分鐘。

10、將管放到預加溫到42℃的循環(huán)水浴中放好的試管回上，恰恰放置90秒，不要搖動(dòng)試管。

11、快速將管轉移到冰浴中，使細胞冷卻１－２分鐘。

12、每管加800μlＳＯＣ培養基（見(jiàn)附錄Ａ）。用水溶將培養基加溫至37℃，然后將管轉移到37℃搖床上，溫育45分鐘細菌復蘇，并且表達質(zhì)粒編碼的抗生素抗性標記基因。如果要求更高的轉化效率，在復蘇期中，應溫和地搖動(dòng)細胞（轉速不超過(guò)225轉/分）。

13、將適當體積（每個(gè)90mm平板可達200μl）已轉化的感受態(tài)細胞轉移到含20mmol/L MgSO4和相應抗生素的ＳＯＢ瓊脂培養基上。如培養物體積太�。ā�10μl）�？稍偌尤鉁�培養基，用一無(wú)菌的彎頭玻棒輕輕地將轉化的細胞涂到瓊脂平板表面。如在一個(gè)90mm平板上鋪200μl以上的感受態(tài)細胞，應離心濃縮細胞，然后用適量ＳＯＣ輕輕重懸細胞。如用四環(huán)素抗性作為選擇標記，全部的轉化混合物可以鋪在一個(gè)單獨的平皿上（或鋪在軟瓊脂中）。然而如選用氨芐青霉素抗性，則只能將一部分培養物（根據實(shí)驗決定）鋪在單獨的平皿上。氨芐青霉素抗性功的增加與平皿上所加細菌數的增加并無(wú)線(xiàn)性比例關(guān)系，這可能是因為被抗生素殺死的細胞可釋放生長(cháng)掏物質(zhì)的緣故。

14、將平板置于室溫直至液體被吸收。

15、倒置平皿，于37℃培養，12-16小時(shí)后可出現菌落。如檢查氨芐青霉素抗性，用轉化細胞鋪增板時(shí)密度較低（每個(gè)90mm平板不超過(guò)104菌落），于37℃培養平板時(shí)不應超過(guò)20小時(shí)。氨芐青霉素抗性的轉化可將β－內酰胺酶分泌到培養基中，迅速滅活菌落周?chē)鷧^域中的抗生素。這樣，鋪平板時(shí)密度太高或培養時(shí)間太長(cháng)都會(huì )導致出現對氨芐青霉素敏感的衛星菌落。在選擇培養基中不用氨芐青霉素而改用羧芐青霉素，以及將抗生素濃度從60μg/ml增至100μg/ml，可使情況有所改善，但不能徹底根除之。

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