通過(guò)平板裂解和刮取制備λ噬菌體原種

1、鋪平板感染培養物的制備：

對直徑為10cm的培養皿，取105pfu的噬菌體（通常約為一個(gè)噬菌斑重懸液的1/10或一個(gè)大噬菌斑重懸液的1/100）與0.1ml鋪平板細菌混勻。

對直徑為15cm的培養皿，去2*105pfu的噬菌體與0.2ml鋪平板細菌混勻。

至少要置一個(gè)含為感染細胞的對照管，將感染培養物和對照均置于37℃培養20min，將病毒吸附到細胞上。

如果制備不易生長(cháng)的λ噬菌體原種、則每0.1ml的鋪平板細菌就要接種106pfu的噬菌體。

2、3ml已熔化的47℃的瓊脂糖（10cm平板）或7ml（15cm平板）至感染細胞的第一個(gè)試管中，通過(guò)輕拍或渦旋振蕩數秒混勻，立即倒入已表明的瓊脂平板中央。盡量避免氣泡的產(chǎn)生。選擇平板確保細菌和頂層瓊脂糖分布均勻。重復這一步，知道每管中的東西均轉移至各個(gè)平板中。

3、將平板于37℃正置約12-16h。

在培養過(guò)程中平板沒(méi)有倒置，是為了防止頂層瓊脂糖滑脫和鼓勵在平皿表面形成水珠，后者使得噬菌體更容易擴散。

在收集時(shí)，噬菌斑應相互接觸，細菌生長(cháng)的惟一可見(jiàn)跡象是標志著(zhù)相鄰噬菌斑結合部位的輕薄透明的邊緣帶。含未感染細胞的屏蔽應形成一光滑的菌苔。

4、收集：

①    當發(fā)生融合裂解時(shí)，加5mlSM于平板中，然后用無(wú)菌的玻璃刮刀輕輕刮取頂層軟瓊脂糖至一無(wú)菌離心管中。

②    再加2ML SM于平板中，沖洗剩下的頂層瓊脂，與上述離心管的頂層瓊脂混合。

③    加0.1氯仿至瓊脂糖懸浮液中，37℃輕搖混勻15min。

④    將懸浮液4000g（5800r/min 于Sorvall  SS-34）4℃離心10min，回收上清，加1滴氯仿。保存病毒原種