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    環(huán)酯紅霉素干混懸劑微生物限度檢查方法的建立



    錄入時(shí)間:2011-9-23 12:02:04 來(lái)源:中國論文下載中心

     

    【摘要】  目的通過(guò)對環(huán)酯紅霉素干混懸劑進(jìn)行驗證試驗,確定適宜的微生物限度檢查的方法。方法及結果 細菌采用薄膜過(guò)濾法,當沖洗量為1 000 mL 時(shí)可消除抑菌作用;真菌采用常規法檢驗,人工污染真菌的回收率均高于70%。結論 環(huán)酯紅霉素干混懸劑微生物限度檢查細菌應采用薄膜過(guò)濾法,沖洗量為1 000 mL ;真菌采用常規法檢驗,大腸埃希菌采用薄膜過(guò)濾法,沖洗量為800 mL。  

    【關(guān)鍵詞】  微生物限度檢查方法 薄膜過(guò)濾法 常規法 抑菌作用 

     環(huán)酯紅霉素干混懸劑為新型大環(huán)內酯類(lèi)抗生素,是紅霉素的半合成衍生物,環(huán)酯化后的紅霉素降低了血清蛋白結合率,提高了抗菌活性和降低了毒性;本品為廣譜抗生素,其注冊質(zhì)量標準中未列微生物限度的檢驗方法。為此,本文對環(huán)酯紅霉素干混懸劑的微生物限度的檢查方法進(jìn)行了驗證試驗。 

      1  試驗材料 

      1.1  樣品  環(huán)酯紅霉素干混懸劑,批號:061101,規格:0.125 g/包,生產(chǎn)廠(chǎng)家: 海南澳美華制藥有限公司。 

      1.2  菌種[1  大腸埃希菌CMCC(B) 44102、枯草芽孢桿菌CMCC(B) 63501、金黃色葡萄球菌CMCC(B)26003、白色念珠菌CMCC(F)98001、黑曲霉CMCC(F)98003 由中國藥品生物制品檢定所提供。 

      1.3  培養基  玫瑰紅鈉瓊脂,批號:040929;營(yíng)養瓊脂,批號:060214;營(yíng)養肉湯,批號:060117;真菌培養基,批號: 050103;膽鹽乳糖培養基,批號: 060117 ,均由北京三藥科技開(kāi)發(fā)公司提供;MUG,批號:051207,由北京牛�;蚣夹g(shù)有限公司提供。 

      2  金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌和枯草芽孢桿菌的驗證[2,3 

      2.1  菌液制備 

      2.1.1  取經(jīng)37 ℃培養1824 h的金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草桿菌的肉湯培養物1 mL9 mL鹽水,10倍稀釋至10-5 10-7,細菌數約為50100  cfu/mL,做活菌計數備用。 

      2.1.2  取經(jīng)25  ℃培養1824 h的白色念珠菌真菌液體培養物1 mL9  mL鹽水,10倍稀釋至10-510-6,細菌數約為50100 cfu/mL,做活菌計數備用。 

      2.1.3  取經(jīng)25  ℃培養1周的黑曲霉斜面培養物,加35 mL鹽水洗下真菌孢子,吸取出菌液, 然后取1  mL 9  mL鹽水,10倍稀釋為10-3,細菌數約為50100 cfu/mL,做活菌計數備用。 

      2.2  供試品的制備  取本品10 g,溶于100 mLpH7.0氯化鈉蛋白胨緩沖液中,作為110供試液。 

      2.3  試驗組  分別取110供試液,500 r/min離心5 min,,分別取上清液1 mL薄膜過(guò)濾,以pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液為沖洗液沖洗,每次100 mL,在最后一次沖洗液中分別加入試驗菌少于100  cfu/mL金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌1 mL;過(guò)濾取出濾膜,分別貼于營(yíng)養瓊脂平皿中于3035 ℃培養,每天觀(guān)察結果,計數。 

      2.4  菌液組  測定每一菌株的試驗菌數,采用平板菌落計數法。 

      2.5  供試品組  不加菌液,其他操作同試驗組,測量樣品本底菌數。 

      2.6  稀釋劑對照組  pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液,按試驗組的沖洗量過(guò)濾,在最后一次沖洗液中逐一加入試驗菌,取出濾膜分別接種于相應培養平皿中培養計數。 

      2.7  結果  采用薄膜過(guò)濾法測定的回收率結果見(jiàn)表1。結果表明,當沖洗量為1 000 mL時(shí),可消除抑菌作用。 

      表1  薄膜過(guò)濾法驗證試驗結果(略) 

      Tab.1  Test  results of membrane filtration

    3  黑曲霉菌和白色念珠菌的驗證[2,3 

      3.1  供試品的制備  取本品10 g,溶于100 mLpH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液中,制成110的供試液。 

      3.2  試驗組  2組平皿,每組2個(gè),分別取110供試液1 mL50100 cfu/mL試驗菌株1 mL同時(shí)加入平皿中,立即傾注瓊脂培養基,2428 ℃培養,每天觀(guān)察結果,計數。 

      3.3  菌液組  測定每一菌株的試驗菌數,采用平板菌落計數法。 

      3.4  供試品組  不加菌液,其他操作同試驗組,測量樣品本底菌數。 

      3.5  結 果  采用常規法測定的回收率結果見(jiàn)表2。結果表明黑曲霉菌和白色念珠菌的回收率均大于70%。 

      表2  常規法驗證試驗結果(略) 

      Tab.2  Test results of plate count method 

      4  控制菌大腸埃希菌檢查方法驗證[2,3 

      4.1  供試品的制備  取本品10 g,溶于100 mLpH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液中,以500 r/min離心5 min10 mL/管),合并上清液作為110的供試液。 

      4.2  試驗組  110供試液10 mL,薄膜過(guò)濾,以pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液為沖洗液沖洗,每次100 mL,共沖洗8, 在最后一次沖洗液中分別加入1 mL大腸埃希菌,過(guò)濾取出膜,培養于100 mL膽鹽乳糖增菌液中, 3035 ℃培養24 h,觀(guān)察結果。 

      4.3  陰性對照組  110供試液10 mL,薄膜過(guò)濾,以pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液為沖洗液沖洗,每次100 mL,共沖洗8, 在最后一次沖洗液中分別加入1 mL金黃色葡萄球菌液,過(guò)濾,取出膜培養于100 mL膽鹽乳糖增菌液中, 3035 ℃培養24 h,觀(guān)察結果。 

      4.4  取上述培養物各0.2 mL接種至5 mLMUG培養基試管內培養,于5 h、24 h365 nm的紫外燈下觀(guān)察,同時(shí)用未接種的MUG培養基做本底對照。結果見(jiàn)表3。 

      表3  大腸埃希菌檢查方法驗證結果(略) 

      Tab.3  Validation test results of Escherichia coli 

      5  討論 

      5.1  從表1結果可知,環(huán)酯紅霉素干混懸劑細菌數檢查采用薄膜過(guò)濾法,通過(guò)不同的沖洗量,測定人工染菌回收率,總沖洗量為800 mL時(shí),金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌回收率均低于70%,方法還是不可行;當總沖洗量為1 000 mL時(shí),人工污染3株代表菌株,金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌的回收率均高于70%,符合中國藥典微生物限度驗證方法的要求,故可采用薄膜過(guò)濾法進(jìn)行檢驗。 

      5.2  環(huán)酯紅霉素干混懸劑為廣譜抗生素,主要作用于細菌,從表2結果可知,采用常規法測定真菌和酵母菌數,人工污染2株代表菌株,白色念珠菌、黑曲霉回收率均高于70%,符合規定中國藥典微生物限度驗證方法的要求,所以真菌和酵母菌數驗證方法首選常規法。 

      5.3  從表3結果可知,環(huán)酯紅霉素干混懸劑的大腸埃希菌檢查可采用薄膜過(guò)濾法,沖洗量為800 mL。 

      5.4  據上述結果,環(huán)酯紅霉素干混懸劑微生物限度檢查中的細菌數采用薄膜過(guò)濾法進(jìn)行檢查,即取本品10 g,100 mLpH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液中,混勻,以500 r/min離心5 min,取上清液1 mL,照薄膜過(guò)濾法處理,以pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液為沖洗液,沖洗量為1 000 mL,真菌和酵母菌數采用常規檢驗,大腸埃希菌可用薄膜過(guò)濾法,沖洗量為800 mL。

    作者:王妤

    【參考文獻】

       �。�1] 國家藥典委員會(huì ).中華人民共和國藥典:二部 [S.北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2005:附錄 79.

     �。�2] 應國紅.18種中成藥污染細菌的回收率試驗[J.江西中醫學(xué)院學(xué)報,2005,173):65.

     �。�3] 杜娟,范兵.三高茶的微生物限度檢查方法驗證研究[J.中國藥事,2006,203):156.

     

     

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