【摘要】 目的通過(guò)對環(huán)酯紅霉素干混懸劑進(jìn)行驗證試驗,確定適宜的微生物限度檢查的方法。方法及結果 細菌采用薄膜過(guò)濾法,當沖洗量為1 000 mL 時(shí)可消除抑菌作用;真菌采用常規法檢驗,人工污染真菌的回收率均高于70%。結論 環(huán)酯紅霉素干混懸劑微生物限度檢查細菌應采用薄膜過(guò)濾法,沖洗量為1 000 mL ;真菌采用常規法檢驗,大腸埃希菌采用薄膜過(guò)濾法,沖洗量為800 mL。
【關(guān)鍵詞】 微生物限度檢查方法 薄膜過(guò)濾法 常規法 抑菌作用
環(huán)酯紅霉素干混懸劑為新型大環(huán)內酯類(lèi)抗生素,是紅霉素的半合成衍生物,環(huán)酯化后的紅霉素降低了血清蛋白結合率,提高了抗菌活性和降低了毒性;本品為廣譜抗生素,其注冊質(zhì)量標準中未列微生物限度的檢驗方法。為此,本文對環(huán)酯紅霉素干混懸劑的微生物限度的檢查方法進(jìn)行了驗證試驗。
1 試驗材料
1.1 樣品 環(huán)酯紅霉素干混懸劑,批號:061101,規格:0.125 g/包,生產(chǎn)廠(chǎng)家: 海南澳美華制藥有限公司。
1.2 菌種[1] 大腸埃希菌CMCC(B) 44102、枯草芽孢桿菌CMCC(B) 63501、金黃色葡萄球菌CMCC(B)26003、白色念珠菌CMCC(F)98001、黑曲霉CMCC(F)98003 由中國藥品生物制品檢定所提供。
1.3 培養基 玫瑰紅鈉瓊脂,批號:040929;營(yíng)養瓊脂,批號:060214;營(yíng)養肉湯,批號:060117;真菌培養基,批號: 050103;膽鹽乳糖培養基,批號: 060117 ,均由北京三藥科技開(kāi)發(fā)公司提供;MUG,批號:051207,由北京牛�;蚣夹g(shù)有限公司提供。
2 金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌和枯草芽孢桿菌的驗證[2,3]
2.1 菌液制備
2.2 供試品的制備 取本品10 g,溶于100 mL的pH7.0氯化鈉蛋白胨緩沖液中,作為1∶10供試液。
2.3 試驗組 分別取1∶10供試液,以500 r/min離心5 min,,分別取上清液1 mL薄膜過(guò)濾,以pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液為沖洗液沖洗,每次100 mL,在最后一次沖洗液中分別加入試驗菌少于100 cfu/mL金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌1 mL;過(guò)濾取出濾膜,分別貼于營(yíng)養瓊脂平皿中于30~35 ℃培養,每天觀(guān)察結果,計數。
2.4 菌液組 測定每一菌株的試驗菌數,采用平板菌落計數法。
2.5 供試品組 不加菌液,其他操作同試驗組,測量樣品本底菌數。
2.6 稀釋劑對照組 取pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液,按試驗組的沖洗量過(guò)濾,在最后一次沖洗液中逐一加入試驗菌,取出濾膜分別接種于相應培養平皿中培養計數。
2.7 結果 采用薄膜過(guò)濾法測定的回收率結果見(jiàn)表1。結果表明,當沖洗量為1 000 mL時(shí),可消除抑菌作用。
表1 薄膜過(guò)濾法驗證試驗結果(略)
Tab.1 Test results of membrane filtration
3 黑曲霉菌和白色念珠菌的驗證[2,3]
3.1 供試品的制備 取本品10 g,溶于100 mL的pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液中,制成1∶10的供試液。
3.2 試驗組 取2組平皿,每組2個(gè),分別取1∶10供試液1 mL和50~100 cfu/mL試驗菌株1 mL同時(shí)加入平皿中,立即傾注瓊脂培養基,于24~28 ℃培養,每天觀(guān)察結果,計數。
3.3 菌液組 測定每一菌株的試驗菌數,采用平板菌落計數法。
3.4 供試品組 不加菌液,其他操作同試驗組,測量樣品本底菌數。
3.5 結 果 采用常規法測定的回收率結果見(jiàn)表2。結果表明黑曲霉菌和白色念珠菌的回收率均大于70%。
表2 常規法驗證試驗結果(略)
Tab.2 Test results of plate count method
4 控制菌大腸埃希菌檢查方法驗證[2,3]
4.1 供試品的制備 取本品10 g,溶于100 mL的pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液中,以500 r/min離心5 min(10 mL/管),合并上清液作為1∶10的供試液。
4.2 試驗組 取1∶10供試液10 mL,薄膜過(guò)濾,以pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液為沖洗液沖洗,每次100 mL,共沖洗8次, 在最后一次沖洗液中分別加入1 mL大腸埃希菌,過(guò)濾取出膜,培養于100 mL膽鹽乳糖增菌液中,于 30~35 ℃培養24 h,觀(guān)察結果。
4.3 陰性對照組 取1∶10供試液10 mL,薄膜過(guò)濾,以pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液為沖洗液沖洗,每次100 mL,共沖洗8次, 在最后一次沖洗液中分別加入1 mL金黃色葡萄球菌液,過(guò)濾,取出膜培養于100 mL膽鹽乳糖增菌液中,于 30~35 ℃培養24 h,觀(guān)察結果。
4.4 取上述培養物各0.2 mL接種至5 mLMUG培養基試管內培養,于5 h、24 h在365 nm的紫外燈下觀(guān)察,同時(shí)用未接種的MUG培養基做本底對照。結果見(jiàn)表3。
表3 大腸埃希菌檢查方法驗證結果(略)
Tab.3 Validation test results of Escherichia coli
5 討論
5.1 從表1結果可知,環(huán)酯紅霉素干混懸劑細菌數檢查采用薄膜過(guò)濾法,通過(guò)不同的沖洗量,測定人工染菌回收率,總沖洗量為800 mL時(shí),金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌回收率均低于70%,方法還是不可行;當總沖洗量為1 000 mL時(shí),人工污染3株代表菌株,金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌的回收率均高于70%,符合中國藥典微生物限度驗證方法的要求,故可采用薄膜過(guò)濾法進(jìn)行檢驗。
5.2 環(huán)酯紅霉素干混懸劑為廣譜抗生素,主要作用于細菌,從表2結果可知,采用常規法測定真菌和酵母菌數,人工污染2株代表菌株,白色念珠菌、黑曲霉回收率均高于70%,符合規定中國藥典微生物限度驗證方法的要求,所以真菌和酵母菌數驗證方法首選常規法。
5.3 從表3結果可知,環(huán)酯紅霉素干混懸劑的大腸埃希菌檢查可采用薄膜過(guò)濾法,沖洗量為800 mL。
5.4 據上述結果,環(huán)酯紅霉素干混懸劑微生物限度檢查中的細菌數采用薄膜過(guò)濾法進(jìn)行檢查,即取本品10 g,置100 mLpH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液中,混勻,以500 r/min離心5 min,取上清液1 mL,照薄膜過(guò)濾法處理,以pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液為沖洗液,沖洗量為1 000 mL,真菌和酵母菌數采用常規檢驗,大腸埃希菌可用薄膜過(guò)濾法,沖洗量為800 mL。
作者:王妤
【參考文獻】
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