康腹止瀉片微生物限度檢查法驗證

【摘要】  目的 建立康腹止瀉片微生物限度檢查法。方法 采用培養基稀釋法。結果 該法能有效消除康腹止瀉片在檢驗條件下對細菌、真菌及酵母菌的抑制作用;控制菌可用常規法檢查。結論 該法簡(jiǎn)單、快捷，可用于康腹止瀉片的微生物限度檢查，有效控制其質(zhì)量。  

【關(guān)鍵詞】  康腹止瀉片;微生物限度檢查;培養基稀釋法

  康腹止瀉片是由木餾油、老鸛草粉、黃柏干浸膏等藥材經(jīng)加工而成的中成藥片劑。本品味特異，具有化滯止瀉功效。用于飲食不節或水土不服導致的食欲不振、惡心嘔吐、腹脹腹瀉、消化不良等癥。處方中的老鸛草、黃柏具有一定的抑菌作用[1，2]，若用常規法對其進(jìn)行微生物限度檢查，結果將不能真實(shí)反映樣品的污染情況[3]。為此，根據《中國藥典》2010年版的有關(guān)規定[4]，對康腹止瀉片微生物限度檢查方法進(jìn)行驗證，以確定其是否適用于本品的微生物限度檢查，從而準確有效地檢出樣品中污染的微生物[5]。驗證表明，采用培養基稀釋法對本品進(jìn)行檢查，可使污染的微生物能被順利檢出，常規法則可用于控制菌的檢查。該方法簡(jiǎn)便、快捷、準確、可行，能有效控制康腹止瀉片的質(zhì)量，并可為同類(lèi)藥品的微生物限度檢查法提供科學(xué)的實(shí)驗依據。 

　　1 儀器與試藥 

　　1.1 菌種 

　　金黃色葡萄球菌[CMCC(B)26003]、大腸埃希菌[CMCC(B)44102]、枯草芽孢桿菌[CMCC(B)63501]、白色念珠菌[CMCC(F)10123]，均購自中國藥品生物制品檢定所;黑曲霉(ATCC16404)購自廣東省微生物研究所。 

　　1.2 培養基 

　　營(yíng)養瓊脂培養基、玫瑰紅鈉瓊脂培養基、營(yíng)養肉湯培養基、改良馬丁培養基、改良馬丁瓊脂培養基、膽鹽乳糖培養基。 

　　1.3 供試品 

　　康腹止瀉片(批號41EA1)，大幸藥品株式會(huì )社。 

　　2 方法與結果 

　　2.1 菌液的制備[4] 

　　2.1.1 大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌 

　　取新鮮培養物接種至營(yíng)養肉湯培養基中，培養18～24 h;培養物用0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液制成每1 mL含菌數為50～100 cfu的菌懸液。用于控制菌驗證時(shí)制成每1 mL含菌數為<100 cfu的菌懸液。 

　　2.1.2 白色念珠菌 取新鮮培養物接種至改良馬丁培養基中，培養24～48 h;培養物用0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液制成每1 mL含菌數為50～l00 cfu的菌懸液。 

　　2.1.3 黑曲霉 取新鮮培養物接種至改良馬丁瓊脂斜面培養基中，培養5～7 d，加入0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液3～5 mL，將孢子洗脫。然后，用適宜的方法吸出胞子懸液至無(wú)菌試管內，用0.05%(體積分數)聚山梨醇的0.9%(體積分數)無(wú)菌氯化鈉溶液制成每l mL含孢子數50～100 cfu的孢子懸液。

2.2 供試液的制備 

　　取樣品10 g，加入pH7.0氯化鈉�驳鞍纂司彌_液至100 mL，用勻漿儀打碎，搖勻，制成1∶10的供試液。 

　　2.3 驗證試驗 

　　驗證實(shí)驗所用培養基均按《中國藥典》2010年版附錄“微生物限度檢查法”要求，進(jìn)行培養基適用性檢查，且均符合規定。 

　　2.3.1 細菌、真菌及酵母菌計數(平皿法�才囵B基稀釋法) 在確定適合的檢查方法后，驗證試驗至少應進(jìn)行3次獨立的平行試驗，并分別計算各試驗菌每次試驗的回收率。 

　　試驗組:各取1∶10供試液1、0.5、0.2 mL和試驗菌液1 mL，分別注入平皿中，立即傾注相應瓊脂培養基，每株試驗菌平行制備2個(gè)平皿，按平皿法測定其菌數。 

　　菌液組:取試驗菌液1 mL注入平皿中，立即傾注相應瓊脂培養基，每株試驗菌平行制備2個(gè)平皿，測定所加的試驗菌數。 

　　供試品對照組:各取1∶10供試液1、0.5、0.2 mL，按試驗組操作，不加菌液，測定樣品本底菌。 

　　計算各試驗菌株的回收率，結果見(jiàn)表1。表1 計數驗證菌各菌株回收率結果 

　　由表1可見(jiàn):黑曲霉的回收試驗，當供試液為1 mL·皿-1時(shí)，3次試驗的回收率均即可達到70%以上;白色念珠菌當稀釋至0.5 mL·皿-1時(shí)，3次試驗的回收率達到70%以上;而大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌3個(gè)菌株的回收率試驗，要稀釋至0.2 mL·皿-1，3次驗證的回收率才能均達到70%以上。因此本品的細菌計數、真菌及酵母菌計數均可用培養基稀釋法檢查:細菌計數用0.2 mL·皿-1，真菌及酵母菌計數用0.5 mL·皿-1。 

　　2.3.2 控制菌檢查法的驗證 本品為含有藥材粉末投料的口服制劑,控制菌應檢查大腸埃希菌和大腸菌群，驗證大腸菌群檢查法時(shí)，采用大腸埃希菌作為試驗菌。 

　　2.3.2.1 大腸埃希菌檢查法的驗證 取1∶10供試液10 mL及大腸埃希菌菌液1 mL加入100、200 mL的BL增菌培養基中，按大腸埃希菌的檢查法進(jìn)行檢驗。 

　　2.3.2.2 大腸菌群檢查法的驗證 取1∶10供試液1 mL及大腸埃希菌菌液1 mL加入不少于15、30 mL的膽鹽乳糖發(fā)酵培養基中，按大腸菌群的檢查法進(jìn)行檢驗。 

　　由表2可知，試驗組均檢出大腸埃希菌，因此本制劑的大腸埃希菌和大腸菌群均可用常規法檢查。 

　　4 討論 

　　本品含有木餾油、阿仙粉、黃柏粉等成分，有一定的抑菌作用，驗證試驗結果證明，本品對革蘭陽(yáng)性菌有較強的抑制作用。藥典收載的除去供試品抑菌作用的方法有培養基稀釋法、薄膜過(guò)濾法、離心沉淀法等，或幾法聯(lián)用。由于本品是中成藥，推斷其抑菌作用不會(huì )太強，因此嘗試采用培養基稀釋法，通過(guò)擴大培養基的使用量，使供試品在培養基中稀釋?zhuān)�結果各規定菌株的回收率均達到藥典要求;控制菌則用常規法即能順利檢出試驗菌。培養基稀釋法操作簡(jiǎn)單，不需要特殊儀器設備，只需增加培養基量，即可很好地消除本制劑在試驗條件下的抑菌作用問(wèn)題，因此本方法簡(jiǎn)便快捷、準確有效，能很好地控制康腹止瀉片的質(zhì)量。表2 控制菌驗證結果

  作者：朱文娟，林鐵豪，鐘燕飛，林麗英  

【參考文獻】

  　[1] 金晴昊，崔京浩，郭健鵬.老鸛草的研究[J].時(shí)珍國醫國藥，2005，16(9)：840-841.

　　[2] 金建玲，欒永娜，華國強.含小檗堿中藥的抑菌活性與小檗堿含量的關(guān)系[J].中醫藥學(xué)報，2005，33(5):19-21.

　　[3] 許華玉，杜鵑，湯楊.藥品中微生物污染檢測方法驗證的必要性[J].中國藥品標準，2005,6(4):262,46-47.

　　[4] 國家藥典委員會(huì ).中華人民共和國藥典:2010年版一部[M].北京:中國醫藥科技出版社,2010:附錄79.

[5] 林麗英,湛文青,饒春意.野牡丹止痢片微生物限度檢查法的建立[J].中藥材,2006,29(3):299-302.

上一篇：頭孢拉定膠囊微生物限度檢查法的驗證分析

下一篇：環(huán)酯紅霉素干混懸劑微生物限度檢查方法的建立