微生物濁度法測定硫酸慶大霉素顆粒的效價(jià)

【摘要】  目的 建立硫酸慶大霉素顆粒效價(jià)的測定方法。 方法 采用比濁法和管碟法對硫酸慶大霉素顆粒的效價(jià)測定進(jìn)行比較,并對比濁法進(jìn)行方法學(xué)驗證。結果 用比濁法測定硫酸慶大霉素顆粒效價(jià),濃度的對數與吸收度成良好的線(xiàn)性關(guān)系,回收率良好;用比濁法測定與管碟法測定的結果無(wú)明顯差異,方法學(xué)驗證說(shuō)明濁度法測定可行。結論 微生物濁度法測定硫酸慶大霉素顆粒效價(jià)的方法可行,且快速、簡(jiǎn)便。

【關(guān)鍵詞】  微生物效價(jià)測定; 濁度法; 管碟法; 硫酸慶大霉素顆粒

　　硫酸慶大霉素是氨基糖苷類(lèi)抗生素,由多個(gè)組分組成,其抗菌機理主要是阻礙細菌蛋白質(zhì)的合成而殺菌,也是現在使用較為廣泛的抗生素。由于硫酸慶大霉素組分較多,用化學(xué)檢測方法還不能完全體現其抗菌能力,所以效價(jià)測定在控制其質(zhì)量方面還不可替代�，F在常用的效價(jià)測量方法還普遍是二劑量管碟法,但是管碟法也有其缺點(diǎn)[1],如檢測時(shí)間過(guò)長(cháng),參數不穩定,受外界干擾較大等。2005年中國藥典收載了比濁法測定抗生素效價(jià)的方法[2,3],但在實(shí)際檢驗中應用尚少,由于顆粒劑含有大量輔料,測定時(shí)更應考慮到相關(guān)輔料的影響。本研究參考了硫酸慶大霉素原料及片劑的濁度法測定方法[4��6],對用濁度法硫酸慶大霉素顆粒劑效價(jià)進(jìn)行了研究,現將具體的試驗內容報告如下。

　　1 儀器與試藥

　　CZB��1抗生素光度測量?jì)x(北京潮聲弘業(yè)科技有限公司);ZY��300IV多功能微生物自動(dòng)測量分析儀(北京先驅威鋒技術(shù)開(kāi)發(fā)公司);島津UV��2450分光光度計;BP211D電子天平(Sartorius,瑞士)。試驗中所用的比色皿,培養基等均在115℃滅菌30 min.慶大霉素標準品(中國藥品生物制品檢定所,批號:130326��200314,效價(jià):638 u/mg);金黃色葡萄球菌 [CMCC(B)26003](中國藥品生物制品檢定所);抗生素檢定培養基Ⅲ(北京三藥科技開(kāi)發(fā)公司);營(yíng)養肉湯培養基(北京三藥科技開(kāi)發(fā)公司);硫酸慶大霉素顆粒A(A廠(chǎng)家,規格40 mg/包,批號:070502,070503);硫酸慶大霉素顆粒B(B廠(chǎng)家,規格10 mg/包,批號:080403,080404)。

　　2 實(shí)驗方法

　　2.1 菌懸液的制備和含菌培養基的制備取金黃色葡萄球菌斜面培養物,接種于50 ml營(yíng)養肉湯培養基中,置35～37℃培養約18 h,臨用前以營(yíng)養肉湯培養基為空白在550 nm的波長(cháng)處測定其吸收度,調整菌液濃度使吸收度為1.0.在抗生素檢定培養基Ⅲ中,加入上述實(shí)驗菌液,加入量為1%(每100 ml中加實(shí)驗菌液1 ml),搖勻,立即使用。并以未加菌的抗生素檢定培養基Ⅲ為陰性空白。

　　2.2 線(xiàn)性范圍及線(xiàn)性關(guān)系取慶大霉素標準品適量,精密稱(chēng)定,用滅菌磷酸鹽緩沖液(pH7.8)制成100 u/ml的溶液,再稀釋制成 1.0、0.8、0.64、0.52、0.41 u/ml溶液,作為線(xiàn)性實(shí)驗標準溶液[5]。取上述標準品溶液各1.0 ml,置儀器配備的比色管中,再分別加入含菌培養基9.0 ml,搖勻,密塞,放入CZB��1抗生素光度測量?jì)x培養。以不含菌液培養基9.0 ml和1.0 ml無(wú)菌水作陰性空白,以含菌液培養基9.0 ml和1.0 ml無(wú)菌水作陽(yáng)性空白。培養溫度37℃,測定波長(cháng)為530 nm.試驗設定的5個(gè)濃度的標準品溶液劑間比為1∶1.25,從0.4 u/ ml～1.0 u/ ml,吸收度大概在0.2～0.6之間,相鄰劑量間的吸收度差約為0.07,有較明顯的劑間差。以濃度(C,u/ ml)的對數為橫坐標X,吸收度(A)為縱坐標Y進(jìn)行線(xiàn)性回歸,顯示線(xiàn)性關(guān)系良好,線(xiàn)性方程為:Y=289.380-869.151 X,r=0.999 0.慶大霉素的濃度劑量為1.0 u/ ml和0.5 u/ ml時(shí),吸收度約為0.3～0.6,選取這兩個(gè)濃度作為二劑量測定時(shí)的抗生素濃度,高低劑量比為2∶1.

　　2.3 回收率考察精密稱(chēng)取慶大霉素標準品適量,用滅菌水制成1 000 u/ ml的標準品溶液。精密量取適量,用滅菌磷酸鹽緩沖液(pH7.8)分別稀釋制成濃度為1.0 u/ ml和0.5 u/ ml的標準品溶液;分別取相當于標示量的85%、100%、115%慶大霉素標準品,按硫酸慶大霉素顆粒處方中慶大霉素與輔料的比例分別加入相應劑量的輔料,同法稀釋制成濃度為1.0 u/ ml和0.5 u/ ml的溶液。分別精密量取上述溶液1.0 ml,置滅菌比色管中,每種溶液各6管,照2.2所述方法測定�；厥章试�99.3%～101.1%之間,平均回收率100.3%,回收良好，結果見(jiàn)表1.表1 硫酸慶大霉素回收率試驗結果

　　2.4 重復性試驗分別取相當于標示量85%、100%、115%慶大霉素標準品適量,按照硫酸慶大霉素處方中慶大霉素與輔料的比例分別加入相應劑量的輔料,同法稀釋制成濃度為1.0 u/ ml和0.5 u/ ml的溶液,用二劑量法分別測定含量3次,其RSD分別為1.6%,1.0%和1.2%.

　　2.5 輔料的影響取空白輔料,按照硫酸慶大霉素顆粒中輔料的量配制不含主藥的空白溶液,照上述方法測定,其生長(cháng)曲線(xiàn)和陽(yáng)性對照完全一致,沒(méi)有抑菌作用,說(shuō)明空白輔料對實(shí)驗無(wú)干擾。

　　2.6 濁度法和管碟法測定結果的比較取慶大霉素標準品及樣品適量,精密稱(chēng)定,用滅菌水制成1 000 u/ ml的標準品溶液,精密量取適量,用滅菌磷酸鹽緩沖液(pH7.8)分別稀釋制成濃度為1.0 u/ ml和0.5 u/ ml的溶液,高低劑量的劑間比為2:1.分別精密量取上述溶液1.0 ml,置滅菌比色管中,每種溶液各6管,分別加入含菌培養基9.0 ml,搖勻,密塞,放入CZB��1抗生素光度測量?jì)x培養3～4 h.陰性對照:磷酸鹽緩沖液(pH7.8)1 ml,加9.0 ml未接種實(shí)驗菌的培養基。分別用管碟法和濁度法的二劑量法對4批硫酸慶大霉素顆粒樣品進(jìn)行含量測定,對4批樣品用管碟法和濁度法測得的含量基本一致,可信限FL(%)濁度法更佳,兩種方法無(wú)顯著(zhù)差異,結果見(jiàn)表2.表2 濁度法與管碟法測定硫酸慶大霉素結果比較

　　3 討論

　　3.1 試驗菌液的制備和對試驗的影響濁度法測定效價(jià)試驗中,試驗菌液的制備和質(zhì)量是影響實(shí)驗的重要因素。制備試驗用菌液有不同的方法[7��10],采用斜面接種試驗菌后再用滅菌水洗下菌體制備菌液也可用于試驗,但是由于接種量難以控制,后期調整菌液濃度操作會(huì )更加繁瑣,而采用這種液體培養基培養菌液的方法更加簡(jiǎn)便,更容易控制菌液的濃度,同時(shí)解決了從斜面培養基上直接洗下菌體制成的菌懸液菌體不均勻的問(wèn)題。

　　3.2 濁度法測定的注意事項用濁度法測定時(shí),培養時(shí)間一般為3～4 h,但最主要的還是要觀(guān)察培養皿內的菌液生長(cháng)情況,以菌液的吸收度在0.3～0.7的范圍內的時(shí)間為最佳,而且高低濃度之間的吸收度差值應大于0.1,這樣才能獲得較好的結果。

　　3.3 輔料量對試驗的影響采用管碟法測定硫酸慶大霉素顆粒效價(jià)時(shí),發(fā)現由于顆粒劑輔料量很大,對試驗結果有一定的影響,而采用濁度法測定時(shí),由于測定濃度很低,樣品溶液中輔料的濃度相應也減少很多,對試驗基本無(wú)干擾。

　　3.4 濁度法測定效價(jià)的優(yōu)勢濁度法較管碟法測定效價(jià)更加簡(jiǎn)便、快捷,管碟法培養時(shí)間長(cháng),一般要16～18 h,要第2 d才能有結果,而濁度法試驗當天便可有試驗結果;同時(shí),濁度法更少了手工制備雙碟的步驟,減少了人為的誤差,試驗結果中可信限(FL%)大大提高。

【參考文獻】

[1] 黃鏡娟.管碟法測定抗生素效價(jià)結果的影響因素分析[J].現代醫藥衛生,2006,22(18):2853.

　　[2] 國家藥典委員會(huì ).中國藥典(二部)[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2005:附錄79.

　　[3] 楊亞莉,胡昌勤.中國藥典2005年版微生物檢定法的增修訂情況及要點(diǎn)[J].中國抗生素雜志,2005,30(12):721.

　　[4] 霍啟錄,邵紅霞.微生物比濁法與管碟法測定硫酸慶大霉素效價(jià)的評價(jià)[J].中國藥房,2000,11(1):37.

　　[5] 田光彩.標準曲線(xiàn)法測定硫酸慶大霉素片的抗生素效價(jià)[J].中國藥業(yè),2007,16(15):33.

　　[6] 毛影.硫酸慶大霉素生物檢定結果準確度探討[J].畜牧市場(chǎng),2008,21(3):50.

　　[7] 范彬,楊雁莉,康勇.微生物濁度法測定吉他霉素的效價(jià)[J].藥物分析雜志,2008,28(7):1114.

　　[8] 郭鈁,蔡美明.微生物濁度法測定紅霉素及其制劑的效價(jià)[J].藥學(xué)與臨床研究,2007,15(4):326.

　　[9] 霍天鳳,趙素珍,宋閆軍.微生物濁度法測定乙酰螺旋霉素的效價(jià)[J].醫藥論壇雜志,2006,27(20):37.

[10] 李正群,姜紅.比濁法測定氯霉素注射液含量[J].中國藥師,2002,5(10):611.

上一篇：談產(chǎn)酸相穩定發(fā)酵類(lèi)型微生物生態(tài)學(xué)研究

下一篇：常用的細胞量測定法