土霉素片微生物限度檢查方法的驗證

【論文關(guān)鍵詞】土霉素片；微生物限度檢查法 
【論文摘要】目的：建立土霉素片的微生物限度檢查方法。 方法：采用薄膜過(guò)濾法對土霉素片處理后，分別進(jìn)行細菌、霉菌及酵母菌計數方法的驗證。結果：金黃色葡萄球菌和白色念珠菌的回收率均大于70%。結論：土霉素片采用薄膜過(guò)濾法檢查微生物限度方法成立。

    土霉素是四環(huán)素類(lèi)抗生素，能特異性地與細菌核糖體30S亞基的A位結合，抑制肽鏈的增長(cháng)和影響細菌蛋白質(zhì)的合成，對細菌有廣譜抑菌作用。因此其微生物限度檢查不能用平皿法，而應采用薄膜過(guò)濾法消除其抑菌作用后再檢查。 
　　 
　　1 材料 
　　1.1 儀器：HWS-250型恒溫恒濕箱（天津蘇瑞科技開(kāi)發(fā)有限公司），集菌儀（杭州泰林生物技術(shù)設備有限公司），薄膜（孔徑0．22um），康氏振蕩器。 
　　1.2 試劑：玫瑰紅鈉瓊脂培養基，營(yíng)養瓊脂培養基，膽鹽乳糖增菌培養基，MUG培養基，甘露醇氯化鈉瓊脂培養基等，均由中國藥品生物制品檢定所提供。 
　　1.3 菌種：陽(yáng)性對照菌：金黃色葡萄球菌（驗證細菌）、白色念珠菌（驗證酵母菌、霉菌）；陰性對照：金黃色葡萄球菌（驗證大腸埃希菌）。所用菌種均由中國藥品生物制品檢定所提供；稀釋劑及沖洗劑為pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液。 
　　1.4 樣品：土霉素片［0.25g（25萬(wàn)單位）］，廠(chǎng)家為河南華利藥業(yè)有限責任公司，批號為07070601。 
　　 
　　2 方法與結果 
　　2.1 細菌、霉菌、酵母菌檢查方法驗證。 
　　2.1.1 細菌檢測方法驗證。 
　　2.1.1.1 試驗組：取供試品10g，加入pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液，于康氏振蕩器上振搖10分鐘，使片分散，500轉、分離心后，分離上清液作為供試液。取上述供試液10ml，加入100ml稀釋劑中，薄膜過(guò)濾，用沖洗液沖洗2次，每次100ml，第3次沖洗液中加入金黃色葡萄球菌菌懸液0.5ml，薄膜過(guò)濾，取出濾膜，面朝上貼于營(yíng)養瓊脂平皿上，35℃培養48小時(shí)，計數。 
　　2.1.1.2 菌液組：取金黃色葡萄球菌菌懸液0.5ml,直接接種于營(yíng)養瓊脂平皿上，35℃培養48小時(shí)，計數。 
　　2.1.1.3 供試品對照組：取上述供試液10ml,加入100ml稀釋劑中，薄膜過(guò)濾，用沖洗液沖洗3次，每次100ml，取出濾膜，面朝上貼于營(yíng)養瓊脂平皿上，35℃培養48小時(shí)，計數。 
　　2.1.1.4 稀釋劑對照組：取稀釋液10ml,薄膜過(guò)濾，用沖洗液沖洗2次，每次100ml,第3次沖洗液中加入0.5ml金黃色葡萄球菌菌懸液，薄膜過(guò)濾，取出濾膜，菌面朝上貼于營(yíng)養瓊脂平皿上，35℃培養48小時(shí)，計數。 
　　2.1.1.5 上述試驗連續做三次，結果如下：�� 
　　金黃色葡萄球菌計數后平均值：�� 
　　稀釋劑對照組菌數：第一次47個(gè)，第二次53個(gè)，第三次49個(gè)；�� 
　　菌液組菌數：第一次58個(gè)，第二次64個(gè)，第三次60個(gè)；�� 
　　試驗組菌數：第一次45個(gè)，第二次54個(gè)，第三次46個(gè)；�� 
　　供試品對照組菌數：第一次0個(gè)，第二次0個(gè)，第三次0個(gè)。 
　　2.1.1.6 計算金黃色葡萄球菌回收率。 
　　2.1.1.6.1 稀釋劑對照組的回收率:(稀釋劑對照組的平均菌落數/菌液組的平均菌落數)×100%�� 
　　第一次：47/58×100%=81.0%
　　第二次: 53/64×100%=82.8%�� 
　　第三次: 49/60×100%=81.7% 
　　2.1.1.6.2 試驗組的回收率:�� 
　　[(試驗組的平均菌落數-供試品對照組平均菌落數)/菌液組平均菌落數]×100%�� 
　　第一次：（45-0）/58×100%=77.6%�� 
　　第二次:（54-0）/64×100%=84.4%�� 
　　第三次:（46-0）/60×100%=76.7% 
　　2.1.2 霉菌、酵母菌檢查方法驗證。 
　　2.1.2.1 試驗組：取供試品10g，加入pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液，于康氏振蕩器上振搖10分鐘，使片分散，500轉、分離心后，分離上清液作為供試液。取上述供試液10ml，加入100ml稀釋劑中，薄膜過(guò)濾，用沖洗液沖洗2次，每次100ml，第3次沖洗液中加入白色念珠菌菌懸液0.5ml，薄膜過(guò)濾，取出濾膜，面朝上貼于營(yíng)養瓊脂平皿上，23℃培養72小時(shí)，計數。 
　　2.1.2.2 菌液組：取白色念珠菌菌懸液0.5ml,直接接種于營(yíng)養瓊脂平皿上，23℃培養72小時(shí)，計數。 
　　2.1.2.3 供試品對照組：取上述供試液10ml,加入100ml稀釋劑中，薄膜過(guò)濾，用沖洗液沖洗3次，每次100ml，取出濾膜，面朝上貼于營(yíng)養瓊脂平皿上，23℃培養72小時(shí)，計數。 
　　2.1.2.4 稀釋劑對照組：取稀釋液10ml,薄膜過(guò)濾，用沖洗液沖洗2次，每次100ml,第三次沖洗液中加入0.5ml白色念珠菌菌懸液，薄膜過(guò)濾，取出濾膜，菌面朝上貼于營(yíng)養瓊脂平皿上，23℃培養72小時(shí)，計數。

2.1.2.5 上述試驗連續做三次，結果如下：�� 
　　白色念珠菌計數后平均值：�� 
　　稀釋劑對照組菌數：第一次56個(gè)，第二次60個(gè)，第三次53個(gè)；�� 
　　菌液組菌數：第一次45個(gè)，第二次47個(gè)，第三次42個(gè)；�� 
　　試驗組菌數：第一次43個(gè)，第二次45個(gè)，第三次44個(gè)；�� 
　　供試品對照組菌數：第一次0個(gè)，第二次0個(gè)，第三次0個(gè)。 
　　2.1.2.6 計算白色念珠菌的回收率。 
　　2.1.2.6.1 稀釋劑對照組的回收率: 
　　(稀釋劑對照組的平均菌落數/菌液組的平均菌落數)×100%�� 
　　第一次：45/56×100%=80.4%�� 
　　第二次: 47/60×100%=78.3%�� 
　　第三次: 42/53×100%=78.2% 
　　2.1.2.6.2 試驗組的回收率: 
　　[(試驗組的平均菌落數-供試品對照組平均菌落數)/菌液組平均菌落數]×100%�� 
　　第一次：（43-0）/56×100%=76.8%�� 
　　第二次:（45-0）/60×100%=75.0%�� 
　　第三次:（44-0）/53×100%=83.0% 
　　2.2 大腸埃希菌檢測方法驗證。 
　　2.2.1 試驗組：取供試品10g，加入pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液，于康氏振蕩器上振搖10分鐘，使片分散，500轉/分離心后，分離上清液作為供試液。取上述供試液10ml，加入100ml稀釋劑中，薄膜過(guò)濾，用沖洗液沖洗2次，每次100ml，第三次沖洗液中加入大腸埃希菌菌懸液0.2ml，薄膜過(guò)濾，取出濾膜，放入100ml膽鹽乳糖培養基中, 35℃培養24小時(shí),取0.2ml上述培養物加入5ml MUG培養基中,24小時(shí)后,加靛基質(zhì)試液5滴,液面呈現玫瑰紅環(huán)。 
　　2.2.2 陰性菌對照組：照上述方法操作，第三次沖洗時(shí)沖洗液中加入2ml金黃色葡萄球菌菌液，薄膜過(guò)濾，取出濾膜加入100ml膽鹽乳糖培養基中，于35℃培養24小時(shí)，再取上述培養物劃線(xiàn)接種于甘露醇氯化鈉瓊脂培養基的平板上，于35℃培養24小時(shí)，未發(fā)現有金黃色葡萄球菌典型菌落。  　 
　　3 討論 
　　3.1 在細菌、霉菌及酵母菌計數方法驗證三次平行試驗中，稀釋劑對照菌回收率均不低于70%，試驗組的菌回收率均不低于70%，照薄膜過(guò)濾法可進(jìn)行土霉素片的細菌、霉菌及酵母菌的檢查。 
　　3.2 通過(guò)大腸埃希菌檢測方法驗證，陰性對照組未檢出金黃色葡萄球菌，試驗組檢出大腸埃希菌，按薄膜過(guò)濾法可進(jìn)行土霉素片的大腸埃希菌檢查。

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