陳香露白露片微生物限度檢查方法驗證研究

【摘要】  　　目的：建立陳香露白露片微生物限度檢查方法。方法：根據該樣品的微生物限度標準，按《中國藥典》2005年版一部附錄微生物限度檢查法的驗證試驗指導原則，用委托廠(chǎng)家3個(gè)批號的陳香露白露片進(jìn)行驗證試驗，以考察確定陳香露白露片微生物限度的檢查方法。首先用常規法進(jìn)行預試驗，初步考察該樣品對試驗菌檢測的影響，然后根據預試驗結果，用離心沉淀集菌法進(jìn)行再試驗。結果：常規法試驗時(shí)，大腸埃希菌、白色念珠菌的回收率均大于70%，而金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的回收率小于70%，控制菌檢查檢出試驗菌。采用離心沉淀集菌法試驗時(shí)，可以有效消除抑菌作用，使金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的回收率大于70%。結論：采用離心沉淀集菌法可以有效消除抑菌作用，簡(jiǎn)便、準確。

【關(guān)鍵詞】  微生物限度檢查 驗證試驗 離心沉淀集菌法

陳香露白露片是一復方中成藥制劑，由川木香、大黃、石菖蒲、陳皮、甘草、次硝酸鉍、氧化鎂、碳酸氫鈉組成，用于胃潰瘍、糜爛性胃炎、胃酸過(guò)多等疾�。�1］�！吨袊�藥典》2005年版規定，在進(jìn)行藥品微生物限度檢查時(shí)，應對所用方法進(jìn)行驗證，以確認所采用的方法適合于該藥品的微生物限度檢查。為此，筆者對陳香露白露片的微生物限度檢查方法進(jìn)行了驗證試驗。

　　1  試驗材料

　　1.1  樣品
   
　　陳香露白露片（云南龍發(fā)制藥有限公司；規格：100片/瓶；批號：060401、060402、060403）。

　　1.2  稀釋劑及培養基
   
　　pH 7.0無(wú)菌氯化鈉�驳鞍纂司彌_液、0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液、TTC營(yíng)養瓊脂培養基、玫瑰紅鈉瓊脂培養基、膽鹽乳糖培養基、MUG培養基、膽鹽乳糖發(fā)酵培養基、營(yíng)養肉湯培養基、改良馬丁培養基。

　　1.3  菌種
   
　　金黃色葡萄球菌［CMCC（B）26003］、大腸埃希菌［CMCC（B）44102］、枯草芽孢桿菌［CMCC（B）63501］、白色念珠菌［CMCC（F）98001］，均來(lái)源于云南省食品藥品檢驗所。

　　2  驗證試驗

　　2.1  試驗菌液的制備
   
　　接種金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌的新鮮培養物至營(yíng)養肉湯培養基中，置30～35 ℃培養18～24 h，分別取上述培養物 1 mL，加0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液 9 mL，10倍遞增稀釋?zhuān)�取稀釋�? mL，加入到1個(gè)平皿中，每種菌的每1個(gè)稀釋級平行制備2個(gè)平皿，傾注營(yíng)養瓊脂培養基，置30～35 ℃培養24～48 h，計數，選擇每1 mL含菌數為50～100 cfu的稀釋級菌懸液，作為驗證試驗用菌懸液。接種白色念珠菌的新鮮培養物至改良馬丁培養基中，置23～28 ℃培養24～48 h，取上述培養物1 mL，加0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液9 mL，10倍遞增稀釋?zhuān)�取稀釋�? mL，加入到1個(gè)平皿中，每1個(gè)稀釋級平行制備2個(gè)平皿，傾注玫瑰紅鈉瓊脂培養基，置23～28 ℃培養72 h，計數，選擇每毫升含菌數為50～100 cfu的稀釋級菌懸液，作為驗證試驗用菌懸液。

　　2.2  供試液的制備
   
　　從兩瓶樣品中取樣品10 g，至滅菌勻漿杯中，加pH 7.0無(wú)菌氯化鈉�驳鞍纂司彌_液至100 mL，經(jīng)勻漿儀混勻，制成1∶10的供試液。陳香露白露片3個(gè)批號樣品同法操作。

　　2.3  細菌數、霉菌及酵母菌數計數方法的驗證

　　2.3.1  預試驗（常規法）
   
　�。�1）試驗組：取1∶10的供試液1 mL，加入到1個(gè)平皿中，同法制備8個(gè)平皿，依次加入金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌的菌懸液1 mL（含50～100 cfu），每種菌平行制備2個(gè)平皿；取1∶100的供試液1 mL，加入到1個(gè)平皿中，同法制備8個(gè)平皿，依次加入金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌的菌懸液1 mL（含50～100 cfu），每種菌平行制備2個(gè)平皿；取1∶1 000的供試液1 mL，加入到1個(gè)平皿中，同法制備8個(gè)平皿，依次加入金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌的菌懸液1 mL（含50～100 cfu），每種菌平行制備2個(gè)平皿。含大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的試驗平皿傾注營(yíng)養瓊脂培養基，置30～35 ℃培養48 h，計數；白色念珠菌的試驗平皿傾注玫瑰紅鈉瓊脂培養基，置23～28 ℃培養72 h，計數。
   
　�。�2）菌液組：分別取已制備好的金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌的菌懸液1 mL（含50～100 cfu），加入到1個(gè)平皿中，每種菌平行制備2個(gè)平皿。含金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌的試驗平皿傾注營(yíng)養瓊脂培養基，置30～35 ℃培養48 h，計數；白色念珠菌的試驗平皿傾注玫瑰紅鈉瓊脂培養基，置23～28 ℃培養72 h，計數。
   
　�。�3）供試品對照組：取1∶10供試液1 mL，加入到1個(gè)平皿中，同法制備4個(gè)平皿。取1∶100供試液1 mL，加入到1個(gè)平皿中，同法制備4個(gè)平皿。取1∶1 000的供試液1 mL，加入到1個(gè)平皿中，同法制備4個(gè)平皿。每一稀釋級中的2個(gè)平皿傾注營(yíng)養瓊脂培養基，置30～35 ℃培養48 h，計數；每一稀釋級中的另2個(gè)平皿傾注玫瑰紅鈉瓊脂培養基，置23～28 ℃培養72 h，計數。
   
　�。�4）試驗組菌回收率計算：菌回收率（%）=（試驗組平均菌落數-供試品對照組平均菌落數）∕菌液組平均菌落數。
   
　�。�5）結果：見(jiàn)表1。大腸埃希菌、白色念珠菌在樣品的1∶10、1∶100、1∶1 000供試液中回收率均大于70%；金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌在樣品的1∶1 000供試液中回收率均大于70%，在樣品的1∶10、1∶100供試液中回收率均小于70%。根據上述情況，筆者采用離心沉淀集菌法進(jìn)行再試驗。

    2.3.2  再試驗（離心沉淀集菌法）
   
　�。�1）試驗組：從100 mL的1∶10供試液中取上清液10 mL，3 000 r/min離心20 min，棄去上清液，留底部集菌液約2 mL，加pH 7.0無(wú)菌氯化鈉�驳鞍纂司彌_液補至10 mL，混勻。取其1 mL加入到1個(gè)平皿中，同法制備4個(gè)平皿，依次加入金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的菌懸液1 mL（含50～100 cfu），每種菌平行制備2個(gè)平皿。另取其1 mL，加入到9 mL pH 7.0無(wú)菌氯化鈉�驳鞍纂司彌_液中，混勻，即為1∶100供試液。取1∶100供試液1 mL加入到1個(gè)平皿中，同法制備4個(gè)平皿，依次加入金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的菌懸液l mL（含50～100 cfu），每種菌平行制備2個(gè)平皿。在制備好的平皿中傾注營(yíng)養瓊脂培養基，置30～35 ℃培養48 h，計數。
   
　�。�2）菌液組：分別取已制備好的金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的菌懸液1 mL（含50～100 cfu），加入到1個(gè)平皿中，每種菌平行制備2個(gè)平皿，傾注營(yíng)養瓊脂培養基，置30～35 ℃培養48 h，計數。
   
　�。�3）供試品對照組：取1∶10供試液1 mL，加入到1個(gè)平皿中，同法制備2個(gè)平皿。取1∶100供試液1 mL，加入到1個(gè)平皿中，同法制備2個(gè)平皿。同法制備4個(gè)平皿。傾注營(yíng)養瓊脂培養基，置30～35 ℃培養48 h，計數。
   
　�。�4）試驗組菌回收率計算：菌回收率（%）=（試驗組平均菌落數﹣供試品對照組平均菌落數）∕菌液組平均菌落數
   
　�。�5）結果：見(jiàn)表2。采用離心沉淀集菌法后，可去除供試液對金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的抑菌作用，使菌回收率大于70%。

　　2.4  控制菌檢查方法的驗證

　　2.4.1  大腸埃希菌檢查方法的驗證
   
　�。�1）試驗組：取1∶10供試液10 mL和大腸埃希菌的菌懸液1 mL（含50～100 cfu），加入到膽鹽乳糖增菌液100 mL中，置35～37 ℃培養18～24 h，按《中國藥典》2005年版一部附錄微生物限度檢查法中的大腸埃希菌檢查法進(jìn)行檢查。
   
　�。�2）陰性對照組：取1∶10供試液10 mL和金黃色葡萄球菌的菌懸液1 mL（含50～100 cfu），加入到膽鹽乳糖增菌液100 mL中，置35～37 ℃培養18～24 h，按《中國藥典》2005年版一部附錄微生物限度檢查法中的大腸埃希菌檢查法進(jìn)行檢查。
   
　�。�3）供試品對照組：取1∶10供試液10 mL，加入到膽鹽乳糖增菌液100 mL中，置35～37 ℃培養18～24 h，按《中國藥典》2005年版一部附錄微生物限度檢查法中的大腸埃希菌檢查法進(jìn)行檢查。
   
　�。�4）結果：試驗組檢出大腸埃希菌，陰性菌對照組結果為陰性，供試品對照組未檢出大腸埃希菌。

　　2.4.2  大腸菌群檢查方法的驗證
   
　�。�1）試驗組：取1∶10、1∶100、1∶1 000供試液各1 mL和大腸埃希菌的菌懸液1 mL（含50～100 cfu），加入到3支膽鹽乳糖發(fā)酵培養液中，置35～37 ℃培養18～24 h，按《中國藥典》2005年版一部附錄微生物限度檢查法中的大腸菌群檢查法進(jìn)行檢查。
   
　�。�2）陰性對照組：取1∶10、1∶100、1∶1 000供試液各1 mL和金黃色葡萄球菌的菌懸液1 mL（含50～100 cfu），加入到3支膽鹽乳糖發(fā)酵培養液中，置35～37 ℃培養18～24 h，按《中國藥典》2005版一部附錄微生物限度檢查法中的大腸菌群檢查法進(jìn)行檢查。
   
　�。�3）供試品對照組：取1∶10、1∶100、1∶1 000供試液各1 mL，加入到3支膽鹽乳糖發(fā)酵培養液中，置35～37 ℃培養18～24 h，按《中國藥典》2005版一部附錄微生物限度檢查法中的大腸菌群檢查法進(jìn)行檢查。
   
　�。�4）結果：試驗組檢出大腸菌群，陰性菌對照組結果為陰性，供試品對照組未檢出大腸菌群。

　　3  討論
   
　　采用常規法試驗時(shí)，該樣品對大腸埃希菌、白色念珠菌的加菌回收率均大于70%，證明其對上述2種供試菌無(wú)抑菌作用。該樣品對金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌有抑菌作用，在1∶10、1∶100的稀釋級，其加菌回收率小于70%，低于《中國藥典》2005年版規定的回收率不得低于70%才視為無(wú)抑菌作用的要求。結合該樣品的物理特性和常規法試驗結果，采用離心沉淀集菌法進(jìn)行試驗后，金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的加菌回收率可大于70%。故陳香露白露片的細菌數檢查可采用離心沉淀集菌法，霉菌及酵母菌數的檢查采用常規法。
   
　　由控制菌檢查方法的驗證試驗結果表明，采用常規法試驗時(shí)，該樣品對大腸埃希菌、大腸菌群的檢查無(wú)干擾，故陳香露白露片的控制菌檢查可采用常規法。
   
　　因安全原因，黑曲霉［CMCC（F）98003］的驗證試驗未進(jìn)行。

【參考文獻】
  　�。�1］ 衛生部藥典委員會(huì ). 衛生部藥品標準. 中藥成方制劑(第八冊)［S］. 北京： 人民衛生出版社， 1993: 87.

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