滋陰明目丸微生物限度檢查方法的建立

【關(guān)鍵詞】  滋陰明目丸；微生物限度檢查；驗證試驗

滋陰明目丸是由熟地黃、黃精、枸杞子、山藥、當歸、川芎等17味中藥組方而成的復方制劑。對其進(jìn)行微生物限度檢查時(shí),按照規定[1],必須進(jìn)行方法驗證試驗,為此本試驗對滋陰明目丸微生物限度的具體檢查方法進(jìn)行了驗證,現總結現報道如下。

　　1  儀器與試藥

    Q/YYX1030-82型電熱手提式壓力滅菌器；101-2s電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海躍進(jìn)醫療器械廠(chǎng))；DHP781型恒溫培養箱(湖北省黃石市醫療器械廠(chǎng))；SPX-250C型恒溫恒濕培養箱(上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫療設備廠(chǎng))；SPX-103型凈化工作臺(安徽蚌凈化設備廠(chǎng))；漩渦混合器(江蘇海門(mén)麒麟醫用儀器廠(chǎng))；CSY-Ⅱ型不銹鋼電熱恒溫水浴鍋(北京醫療設備廠(chǎng))。
    菌種：大腸埃希菌[CMCC(B)44102]；金黃色葡萄球菌[CMCC(B)26003]；枯草芽孢桿菌 [CMCC(B)63501]；白色念珠菌[CMCC(F)98001]；黑曲霉菌[CMCC(F)98003]。

    營(yíng)養瓊脂培養基(中國藥品生物制品檢定所,批號20050103)；玫瑰紅鈉瓊脂培養基(中國藥品生物制品檢定所,批號20061109)；膽鹽乳糖增菌培養基(中國藥品生物制品檢定所,批號20070106)；改良馬丁瓊脂培養基(中國藥品生物制品檢定所,批號20060915)；MUG快檢試劑(中國藥品生物制品檢定所,批號20061211)；蛋白胨(上海中洋生物公司東海藥廠(chǎng),批號060512)。其他試劑均為分析純。pH 7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖溶液,照2005年版《中華人民共和國藥典》(一部)配制。

    試驗樣品：滋陰明目丸(本院自制,批號070305、070419、070821)。

　　2  實(shí)驗方法與結果

　　2.1  菌液制備

    取經(jīng)37 ℃培養18～24 h的大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌與枯草芽孢桿菌3種菌種,分別接種于10 mL營(yíng)養肉湯中,置37 ℃培養箱中接著(zhù)18～24 h,用0.9%滅菌氯化鈉溶液稀釋至1O-5～1O-7約為5O～100 cfu,備用。
   
　　取白色念珠菌接種于10 mL改良馬丁培養基中,置23～28 ℃培養18～24 h,用0.9%滅菌氯化鈉溶液稀釋至1O-5～1O-7約為5O～100 cfu,備用。
   
　　取經(jīng)23～28 ℃培養1周的黑曲霉改良馬丁瓊脂斜面培養物,加0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液3～5 mL,將孢子洗脫,用管口帶有薄無(wú)菌棉花的無(wú)菌毛細吸管吸出孢子懸液,置無(wú)菌試管內,用0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液稀釋為1 mL含孢子數5O～100 cfu的孢子懸液,備用。

　　2.2  供試液的制備

    各取2個(gè)最小包裝共10 g供試品(批號060402),加入pH 7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100 mL,振搖,使分散均勻,作為1∶10的供試液。

　　2.3  細菌、霉菌及酵母菌計數方法的驗證

    試驗組：取供試液1 mL和5O～100 cfu試驗菌,分別注入平皿中,每株菌平行制備2個(gè)平皿。菌液組：測定所加的試驗菌數。供試品對照組：取供試液注入平皿中,測定供試品本底菌數。稀釋劑對照組：取稀釋劑和5O～100 cfu試驗菌,分別注入平皿中,測定每株平行制備2個(gè)平皿。結果見(jiàn)表1。表1  回收率測定結果（略）

　　表1結果表明,3次平行試驗,滋陰明目丸5株菌的回收率均大于7O%,表明滋陰明目丸按常規法進(jìn)行細菌、霉菌及酵母菌計數,經(jīng)方法學(xué)驗證試驗成立。

    2.4  大腸菌群的驗證試驗

    試驗組：取1∶10、1∶100的供試液1 mL,分別接入10 mL膽鹽乳糖發(fā)酵培養基中,分別加入大腸埃希菌混懸液1 mL, 30～35 ℃培養24 h,觀(guān)察結果。陰性對照組：除菌液為金黃色葡萄球菌1 mL,方法同試驗組。陽(yáng)性對照組：除不加供試液,其他操作同試驗組。結果見(jiàn)表2。表2  大腸菌群驗證試驗結果（略）

　　2.5  控制菌驗證試驗

    試驗組：取批號為060402的1∶10供試液10 mL,加入大腸埃希菌液1 mL,接入100 mL膽鹽乳糖培養基中,35 ℃培養24 h；取上述培養物0.2 mL,接種至5 mL MUG培養基的試管中,35 ℃培養24 h；觀(guān)察后,沿管壁加入數滴靛基質(zhì)試液,觀(guān)察結果。陰性菌對照組：除菌液為金黃色葡萄球菌1 mL,方法同試驗組。陽(yáng)性對照組：除不加供試液,其他操作同試驗組。結果見(jiàn)表3。表3  大腸埃希菌驗證試驗結果（略）

    滋陰明目丸3次平行試驗,試驗組都檢出大腸埃希菌,陰性菌對照組都未檢出金黃色葡萄球菌,表明滋陰明目丸的控制菌檢查方法按常規法,經(jīng)方法學(xué)驗證試驗成立。

　　2.6  樣品檢驗結果

    取滋陰明目丸3批供試品(070305、070419、070821)稀釋液按常規法進(jìn)行細菌、霉菌及酵母菌計數、控制菌檢查,經(jīng)檢驗符合規定。

　　3  結論

    通過(guò)方法學(xué)驗證試驗得出：滋陰明目丸可按常規法進(jìn)行微生物限度檢查；進(jìn)行霉菌及酵母菌計數和控制菌檢查,按培養基稀釋法(0.2 mL/皿)進(jìn)行細菌計數。

　　4  討論

    由于中成藥是含有多種成分的復合制劑,作用機理并不十分明確,其中任何成分具有抑菌作用均可影響微生物限度檢查的準確性。因此,在研究滋陰明目丸微生物檢查方法時(shí),以2005年版《中華人民共和國藥典》作為依據,并參考文獻[2-3]將5種陽(yáng)性對照菌的回收率作為評價(jià)所采用的方法是否適合于本品種。
  
　　采用常規法檢查滋陰明目丸的細菌、霉菌及酵母菌,回收率顯示,本品對大腸埃希菌、白色念珠菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、黑曲霉均無(wú)抑制性。采用常規法檢查滋陰明目丸的控制菌,結果符合藥典規定。

【參考文獻】
  　　[1] 國家藥典委員會(huì ).中華人民共和國藥典(一部)[S].北京：化學(xué)工業(yè)出版社,2005.附錄70.

　　[2] 中國藥品生物制品檢定所.中國藥品檢驗標準操作規范[M].北京：中國醫藥科技出版社,2005.326－328.

　　[3] 馬緒榮,蘇德模.藥品微生物學(xué)檢驗手冊[M].北京：科學(xué)出版社,2000.65.

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