龍膽瀉肝丸微生物限度檢查方法驗證

【摘要】  目的：建立一種龍膽瀉肝丸微生物限度檢查方法。方法：采用藥典規定的常規法和稀釋法，通過(guò)驗證確認所采用的方法是否適合于*該藥品的細菌、霉菌和酵母菌、控制菌的檢查。結果：細菌、霉菌和酵母菌方法驗證中回收率在70%以上;控制菌方法驗證中陽(yáng)性對照菌檢出，陰性對照菌未檢出。結論：龍膽瀉肝丸微生物限度檢查法的細菌、霉菌和酵母菌數可以采用常規法或稀釋法進(jìn)行檢查，控制菌檢查可以采用常規法檢查。

【關(guān)鍵詞】  微生物限度; 驗證

當建立藥品的微生物限度檢查時(shí)，應進(jìn)行細菌、霉菌及酵母菌計數方法的驗證，以確認所采用的方法適合于該藥品的細菌、霉菌及酵母菌的測定。驗證試驗可與供試品的細菌、霉菌及酵母菌計數同時(shí)進(jìn)行。

　　1 實(shí)驗材料

　　1.1 培養基

　　營(yíng)養瓊脂培養基、玫瑰紅鈉瓊脂培養基、膽鹽乳糖培養基、膽鹽乳糖發(fā)酵培養基、營(yíng)養肉湯培養基、改良馬丁液體培養基、改良馬丁瓊脂培養基、MUG培養基、靛基質(zhì)試液。

　　1.2 菌種

　　大腸埃希菌[CMCC(B)44102]、 金黃色葡萄球菌[CMCC(B)26003]、枯草芽孢桿菌[CMCC(B)63501]、白色念珠菌[CMCC(F)98001]、黑曲霉[CMCC(F)98003]。

　　1.3 供試品

　　龍膽瀉肝丸。

　　2 菌液的制備

　　2.1 大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌菌液制備

　　取大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的營(yíng)養瓊脂斜面培養物接種于10ml營(yíng)養肉湯培養基中，35～37℃培養18～24小時(shí);取培養液1ml加0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液9ml，采用10倍遞增稀釋法，稀釋至10-6或10-7，制成每1ml含菌數50～100cfu的菌懸液。

　　2.2 白色念珠菌菌液制備

　　取白色念珠菌的改良馬丁瓊脂斜面培養物接種于10ml改良馬丁培養基中，23～28℃培養24～48小時(shí);取培養液1ml加0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液9ml，采用10倍遞增稀釋法，稀釋至10-6或10-7，制成每1ml含菌數50～100cfu的菌懸液。

　　2.3 黑曲霉菌液制備

　　取黑曲霉的新鮮培養物至改良馬丁瓊脂斜面培養基中，23～28℃培養5～7天，加入3～5ml0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液,將孢子洗脫，吸至無(wú)菌試管中，取1ml加0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液9ml，采用10倍遞增稀釋法，稀釋至10-4～10-6，制成每1ml含孢子數50～100cfu的孢子懸液。

　　3 供試液的制備

　　取供試品10g，加pH7.0的無(wú)菌氯化鈉�驳鞍纂司彌_液至100ml,用勻漿儀混勻，作為1:10供試液。

 　 4 回收率測定

    4.1.1 試驗組

　　(1)常規法：取1:10供試液1ml、菌液(10-6約50～100cfu)1ml，分別同時(shí)注入于平皿中，做10個(gè)平皿;立即傾注營(yíng)養瓊脂培養基，待凝固后，置30～35℃培養48小時(shí)，逐日觀(guān)察結果。(2)稀釋法：取1:10供試液1ml等量分注入于5個(gè)平皿中，每個(gè)平皿加試驗菌 (10-6約50～100cfu)1ml，立即傾注營(yíng)養瓊脂培養基，待凝固后，置30～35℃培養48小時(shí)，逐日觀(guān)察結果。

　　4.1.2 菌液組 取上述試驗菌液，測定每一菌株所加的試驗菌菌數。采取平皿法，取試驗用的菌液(10-6約50～100cfu)1ml，分別注入平皿中，立刻傾注培養基，每株試驗菌平行制備2個(gè)平皿，按平皿法測定其菌落數。

　　4.1.3 供試品對照組 (1)常規法：取1:10供試液1ml注入于平皿中，做2個(gè)平皿;立即傾注營(yíng)養瓊脂培養基，待凝固后，置30～35℃溫度培養48小時(shí)，逐日觀(guān)察結果。(2)稀釋法：取1:10供試液1ml等量分注于5個(gè)平皿中，立即傾注營(yíng)養瓊脂培養基，待凝固后，置30～35℃培養48小時(shí)，逐日觀(guān)察結果。

　　4.2 霉菌、酵母菌回收率測定

　　4.2.1 試驗組 取1:10供試液1ml、菌液(10-6約50～100cfu)1ml，分別同時(shí)注入于平皿中，立即傾注玫瑰紅鈉瓊脂培養基，待凝固后，置23～28℃培養72小時(shí)，逐日觀(guān)察結果。

　　4.2.2 菌液組 同4.1.2。

　　4.2.3 供試品對照組 取1:10供試液1ml注入于平皿中，立即傾注玫瑰紅鈉培養基，待凝固后，置規定溫度培養72小時(shí)，逐日觀(guān)察結果。

　　4.3 細菌、霉菌和酵母菌計數及驗證結果

　　表1 細菌、霉菌和酵母菌計數及方法驗證的試驗　以上數據為3次試驗結果(注：稀釋法中枯草芽孢桿菌回收率不易達到70%)。

　　5 控制菌方法的驗證

　　取2瓶100ml膽鹽乳糖培養基，分別加入1:10供試液各10ml，其中1瓶加入大腸埃希菌液1ml,另1瓶加入金黃色葡萄菌液1ml，置35～37℃培養24小時(shí)，分別取上述培養液0.2ml接種于5mlMUG培養基中，培養于5小時(shí)、24小時(shí)在366nm紫外線(xiàn)下觀(guān)察，觀(guān)察后，沿培養管的管壁加入數滴靛基質(zhì)試液。試驗重復3次(表2)。表2 控制菌檢查方法驗證試驗結果

　　6 討論

　　由表1結果看出，細菌、霉菌和酵母菌試驗組的回收率在70%以上，說(shuō)明龍膽瀉肝丸微生物限度檢查法的細菌數和霉菌、酵母菌數可以采用常規法和稀釋法兩種方法中的任一種進(jìn)行測定。由表2結果可以看出，陽(yáng)性對照菌檢出，陰性對照菌未檢出，說(shuō)明龍膽瀉肝丸控制菌檢查可以采用常規法測定。

【參考文獻】
  　1國家藥典委員會(huì )編.中華人民共和國藥典.北京：化工工業(yè)出版社，2005.

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