甘草有益微生物的研究進(jìn)展

【摘要】  植物體內大量分布的微生物對植物產(chǎn)生的影響已成為人們關(guān)注的熱點(diǎn)，特別是那些有益的影響可對植物的生長(cháng)及活性成分的形成產(chǎn)生一定的作用。甘草作為一種大宗中藥，其栽培品的質(zhì)量一直是人們所關(guān)心的問(wèn)題，甘草有益微生物對提高甘草的品質(zhì)有重要作用。該文綜述了甘草有益微生物的研究進(jìn)展，以期對提高栽培甘草的質(zhì)量起到指導意義。

【關(guān)鍵詞】  甘草; 內生菌; 根瘤菌; 菌根真菌

甘草是豆科甘草屬(Glycyrrhiza)植物，其根及根莖為常用中藥，市場(chǎng)需求量大。近年來(lái)，隨著(zhù)野生甘草資源的急劇減少，且國家明令禁止采挖野生甘草，使甘草供求矛盾日益尖銳。在這種情況下，對甘草資源的保護性利用及栽培甘草勢在必行。近年來(lái)，隨著(zhù)人工甘草種植面積的逐年加大，提高甘草的質(zhì)量成為亟待解決的一個(gè)關(guān)鍵問(wèn)題。相關(guān)研究表明，植物有益微生物可以產(chǎn)生促植物生長(cháng)的活性物質(zhì)，提高植物固氮性能，促進(jìn)植物對惡劣環(huán)境的適應，加強系統的生態(tài)平衡，保證寄主植物健康生長(cháng)。因此本文就近年來(lái)甘草有益微生物的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，以期對提高栽培甘草的質(zhì)量有指導意義。

　　1  甘草內生菌的研究現狀

    內生菌是指一生或至少一生中的某個(gè)階段能進(jìn)入活體植物組織內，并且不引起明顯組織變化的真菌或細菌［1,2］。1993年，Strobel等［3］從短葉紅豆杉Taxus brevifolia Nutt的樹(shù)皮中分離出二百多種微生物，其中有一株內生真菌Taxomyces andreanae能產(chǎn)生紫杉醇，這一研究結果引起學(xué)者對內生菌的廣泛興趣。目前，人們已經(jīng)從長(cháng)春花、千層塔、銀杏、厚樸等多種植物中分離得到了內生菌，并取得了一些成果。

    有學(xué)者對甘草內生菌也進(jìn)行了研究，發(fā)現內生菌對甘草產(chǎn)生一系列作用。宋素琴等［4］對采自新疆的健康野生脹果甘草不同組織中的內生菌進(jìn)行分離，并純化得到149株細菌和2株真菌，鑒定得出149株細菌分屬于13個(gè)屬，2株真菌分屬于青霉菌屬Penicillium和鐮刀菌屬Fusarium。有學(xué)者發(fā)現內生菌可通過(guò)拮抗病原菌促進(jìn)甘草生長(cháng)。饒小莉等［5］從烏拉爾甘草健康植株的根莖葉中共分離到內生細菌98株，并采用平板對峙方法篩選出6株菌株，其對植物病原菌有明顯體外拮抗活性，鑒定這6株拮抗菌株分屬萎縮芽孢桿菌(Bacillus atrophaeus)、多粘類(lèi)芽孢桿菌(Paenibacillus polymyxa)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、Paenibacillus ehimensis。龔明福等［6］采用無(wú)菌操作技術(shù)從野生健康甘草Glycyrrhiza uralensis的根、莖、葉、種子、根瘤等組織中分離出內生細菌（Endophytic bacteria)125株，其中31株對棉花枯萎病菌(Fusarium oxysporum)、棉花黃萎病菌(Verticillium dahliae)具有較強的拮抗活性，這31株內生細菌分屬于氣芽孢桿菌屬(Aerobacillus sp.)、氣單胞菌屬(Aeromonas sp.)、芽孢桿菌屬(Bacillus sp.)、黃單孢桿菌屬(Xanthomonas sp.)、假單胞桿菌屬(Pseudomonas sp.)、土壤桿菌屬(Agrobacterium sp.)。另有研究發(fā)現，從甘草中分離的有些內生菌還可產(chǎn)生活性物質(zhì)。韋革宏等［7］從烏拉爾甘草和光果甘草中共分離得到68株內生菌，從中篩選出一個(gè)來(lái)自烏拉爾甘草的菌株Mesorhizobium sp. CCNWGX022，從該菌株發(fā)酵液的石油醚提取物中分離得到了十八烷酸內酯Rhizobialide，是第一次從內生菌中得到此類(lèi)物質(zhì)。另有學(xué)者研究了內生菌在甘草不同部位及不同月份的數量變化趨勢。林世利等［8］分離出不同月份苦豆子、駱駝刺、苜蓿、鈴鐺刺、甘草不同部位的內生細菌，研究阿拉爾地區豆科植物內生細菌種群動(dòng)態(tài)。結果顯示5月份的苦豆子和甘草植株、8月份的苜蓿植株、9月份的鈴鐺刺和駱駝刺植株的內生細菌的種類(lèi)最多。內生細菌種類(lèi)的分布規律依次為苦豆子中葉＞莖＞根＞種子＞花，苜蓿中根＞葉＞莖＞花＞種子，鈴鐺刺中莖＞葉＞種子＞花＞根，駱駝刺中根＞莖≥葉＞種子＞花，甘草中莖＞根＞葉＞種子＞花。5種豆科植物生長(cháng)期中總帶菌量平均值在各個(gè)月份變化趨勢不同，并且各個(gè)月份的帶菌量處于交替變化之中，說(shuō)明不同月份5種豆科植物內生細菌的種類(lèi)和數量不同，同種豆科植物不同組織部位的內生細菌的種類(lèi)和數量有差異。

　　2  甘草根瘤菌的研究現狀

    根瘤菌是與豆科植物共生，形成根瘤并固定空氣中的氮氣供植物營(yíng)養的一類(lèi)桿狀細菌。這種共生體系具有很強的固氮能力。根瘤菌分快生和慢生兩種類(lèi)型，為化能異養菌。目前有學(xué)者已經(jīng)從甘草中分離得到根瘤菌并進(jìn)行了一些相關(guān)研究。

    目前對甘草根瘤菌的研究多體現在根瘤菌的分類(lèi)上。楊雪穎等［9］通過(guò)對西北干旱半干旱地區68株甘草根瘤菌的表型多樣性和抗逆性分離研究，發(fā)現1個(gè)新類(lèi)群和1個(gè)具有較高抗逆性的菌株。對新類(lèi)群的中心菌株CCNWGX022和高抗性菌株CCNWGX035進(jìn)行16SrDNA全序列測定及系統進(jìn)化研究。結果表明，CCNWGX022和CCNWGX035與中慢生根瘤菌屬內參比菌株的16SrDNA相似性分別大于96.8％和98.3％，判定它們均屬于中慢生根瘤菌屬。谷峻等［10］采用表型數值分類(lèi)、16S rDNA PCR-RFLP分析和BOX-PCR指紋圖譜分析的方法對中國北方地區的甘草根瘤菌進(jìn)行表型、遺傳多樣性分析。供試菌株在數值分類(lèi)聚類(lèi)分析中約85％的相似水平上產(chǎn)生2個(gè)表觀(guān)群，有11株菌未與已知參比菌株聚群。16Sr DNA PCR-RFLP分析表明，供試的20株菌共產(chǎn)生14種遺傳型，表現出豐富的遺傳多樣性。BOX-PCR指紋圖譜分析進(jìn)一步證明與甘草共生的根瘤菌的基因組也具有多樣性。由此得出結論：在中國北方地區與甘草共生的根瘤菌在Sinorhizobium、Rhizobium和Mesorhizobium屬中均有分布。

　　3  甘草菌根真菌的研究現狀

    菌根是土壤中某些真菌與植物根的共生體。凡能引起植物形成菌根的真菌稱(chēng)為菌根真菌，大部分屬擔子菌亞門(mén)，小部分屬子囊菌亞門(mén)。菌根真菌與植物之間建立相互有利、互為條件的生理整體，并各有形態(tài)特征，這是真核生物之間實(shí)現共生關(guān)系的典型代表。根據形態(tài)和解剖學(xué)的特征，又把菌根分為外生菌根和內生菌根兩大類(lèi)。有學(xué)者對甘草菌根真菌進(jìn)行研究發(fā)現菌根真菌可促進(jìn)甘草的生長(cháng)。饒小莉等［11］分離了甘草的VA菌根，并用三葉草進(jìn)行單孢繁殖，將繁殖后的菌根真菌回接甘草，結果發(fā)現接種了菌根真菌的甘草植株筆長(cháng)、根粗、莖葉干重和根干重都有較大程度的提高，均比對照顯著(zhù)增加，并且不同處理對植株生長(cháng)影響不同，得出結論接種VA菌根真菌顯著(zhù)促進(jìn)了甘草的營(yíng)養生長(cháng)。Jingnan Liu等［12］用兩種AM菌根真菌Glomus mosseae與Glomus versiforme接種甘草，結果顯示接種的甘草相對于對照組在生長(cháng)的早期和晚期有顯著(zhù)提高，葉攝取磷的量比對照組多，并且根中甘草酸的濃度有所升高，但根部氧化酶活性相對降低了，由此得出結論接種AM菌根真菌有可能成為提高甘草藥用價(jià)值的有效途徑。

    4  甘草其他微生物學(xué)相關(guān)研究現狀

    近年來(lái)，對甘草微生物學(xué)轉化等方面的研究工作也取得了一定成果。謝毛成［13］利用發(fā)根農桿菌的Ri質(zhì)粒，以光果甘草種子胚萌發(fā)形成的實(shí)生苗不同部位為外植體，成功誘導出光果甘草毛狀根，并利用TLDNA中rolC序列中的特異性引物，應用PCR技術(shù)對光果甘草毛狀根進(jìn)行了分子水平的鑒定，并利用理化手段對毛狀根轉化后產(chǎn)生的冠瘦堿進(jìn)行了薄層定性鑒定，從不同水平上證實(shí)了光果甘草毛狀根核基因組中已整合了外源Ri質(zhì)粒的T-DNA片段。燕飛等［14］利用發(fā)根農桿菌R1601對藥用植物脹果甘草(Glycyrrhiza inflat Bat)進(jìn)行轉化，誘導其產(chǎn)生發(fā)根。在發(fā)根誘導過(guò)程中，分別用不同菌液濃度、不同浸染時(shí)間對脹果甘草子葉、胚軸進(jìn)行轉化處理，統計、比較各條件下的發(fā)根率，結果表明，用稀釋2倍的菌液浸染子葉8 min時(shí)，發(fā)根誘導率最高,為56.49%。何晨等［15］用一株產(chǎn)β-葡糖醛酸酶的菌種HC-12對甘草進(jìn)行液體發(fā)酵轉化。通過(guò)對菌種復合誘變以及應用系統數值化及靈敏值系統調控技術(shù)優(yōu)化了發(fā)酵工藝，把甘草中不足0.1%的甘草次酸的含量提高了20倍以上。經(jīng)過(guò)柱層析及HPLC及1H NMR鑒定分離得到了甘草次酸純品，并通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗驗證了發(fā)酵甘草于未發(fā)酵的生品對照甘草具有抗炎活性和鎮痛作用顯著(zhù)性效果。

　　5  小結

    內生菌對甘草的有益作用體現在：①內生菌有促進(jìn)甘草生長(cháng)作用，內生菌可與病原菌競爭營(yíng)養或直接產(chǎn)生拮抗物質(zhì)而抑制病原菌，從而促進(jìn)甘草生長(cháng)。②有些內生菌可產(chǎn)生活性物質(zhì)。③內生菌在甘草不同部位及不同月份的數量呈現一定的變化趨勢。另有研究表明，內生菌能產(chǎn)生與宿主相同的活性物質(zhì)［3］，王興紅［16］推測內生真菌可能與中藥的道地性有密切的關(guān)系。這些成果對于甘草內生菌的研究有重要意義。

    根瘤菌對甘草的有益作用體現在：根瘤菌能夠通過(guò)與甘草共生，引起甘草根部或莖部結瘤，將空氣中的N2轉化為可吸收利用的NH4，從而為甘草提供氮素營(yíng)養，促進(jìn)其生長(cháng)。

    菌根真菌對甘草的有益作用體現在：甘草和菌根真菌是一種互惠共生的關(guān)系，它們之間可以交換各自所需的物質(zhì)，甘草借助菌根真菌吸收水分、養分和生長(cháng)促進(jìn)劑，而菌根真菌也從甘草中攝取自身生長(cháng)所需要的糖分和其它有機物。菌根真菌是根系的延長(cháng)和擴展，且比根系吸收水分、養分的能力大得多，可促進(jìn)甘草的營(yíng)養生長(cháng)，提高甘草的藥用價(jià)值。

    微生物轉化對甘草的作用體現在：對甘草進(jìn)行微生物轉化，可提高其有效成分含量，用藥效果可得到提高。

    總之，微生物是個(gè)潛力巨大、尚待開(kāi)發(fā)的資源，對甘草相關(guān)微生物進(jìn)行研究有重大意義，有利于提高甘草的質(zhì)量，對于中藥的可持續發(fā)展也將起到重大作用。

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