一、無(wú)菌技術(shù)
微生物通常是肉眼看不到的微小生物，而且無(wú)處不在。因此，在微生物的研究及應用中，不僅需要通過(guò)分離純化技術(shù)從混雜的天然微生物群中分離出特定的微生物，而且還必須隨時(shí)注意保持微生物純培養物的“純潔”，防止其他微生物的混入。在分離、轉接及培養純培養物時(shí)防止其被其他微生物污染的技術(shù)被稱(chēng)為無(wú)菌技術(shù)（aseptic technique），它是保證微生物學(xué)研究正常進(jìn)行的關(guān)鍵。
1. 微生物培養的常用器具及其滅菌
試管、玻璃燒瓶、平皿（culture dish，Petri dish）等是最為常用的培養微生物的器具，在使用前必須先行滅菌，使容器中不含任何生物。培養微生物的營(yíng)養物質(zhì)（稱(chēng)為培養基（culture medium））可以加到器皿中后一起滅菌，也可在單獨滅菌后加到無(wú)菌的器具中。最常用的滅菌方法是高壓蒸汽滅菌，它可以殺滅所有的生物，包括最耐熱的某些微生物的休眠體，同時(shí)可以基本保持培養基的營(yíng)養成分不被破壞。有些玻璃器皿也可采用高溫干熱滅菌。為了防止雜菌，特別是空氣中的雜菌污染，試管及玻璃燒瓶都需采用適宜的塞子塞口，通常采用棉花塞，也可采用各種金屬、塑料及硅膠帽，它們只可讓空氣通過(guò)，而空氣中的其他微生物不能通過(guò)。而平皿是由正反兩平面板互扣而成，這種器具是專(zhuān)為防止空氣中微生物的污染而設計的。
2. 接種操作
用接種環(huán)或接種針?lè )蛛x微生物，或在無(wú)菌條件下把微生物由一個(gè)培養器皿轉接到另一個(gè)培養容器進(jìn)行培養，是微生物學(xué)研究中最常用的基本操作。由于打開(kāi)器皿就可能引起器皿內部被環(huán)境中的其他微生物污染，因此微生物實(shí)驗的所有操作均應在無(wú)菌條件下進(jìn)行，其要點(diǎn)是在火焰附近進(jìn)行熟練的無(wú)菌操作（圖2-1），或在無(wú)菌箱或操作室內無(wú)菌的環(huán)境下進(jìn)行操作（圖2-2）。操作箱或操作室內的空氣可在使用前一段時(shí)間內用紫外燈或化學(xué)藥劑滅菌。有的無(wú)菌室通無(wú)菌空氣維持無(wú)菌狀態(tài)。
用以挑取和轉接微生物材料的接種環(huán)及接種針，一般采用易于迅速加熱和冷卻的鎳鉻合金等金屬制備，使用時(shí)用火焰灼燒滅菌。而移植液體培養物可采用無(wú)菌吸管或移液槍。
二、用固體培養基分離純培養
單個(gè)微生物在適宜的固體培養基表面或內部生長(cháng)、繁殖到一定程度可以形成肉眼可見(jiàn)的、有一定形態(tài)結構的子細胞生長(cháng)群體，稱(chēng)為菌落（colony）。當固體培養基表面眾多菌落連成一片時(shí)，便成為菌苔（lawn）。不同微生物在特定培養基上生長(cháng)形成的菌落或菌苔一般都具有穩定的特征，可以成為對該微生物進(jìn)行分類(lèi)、鑒定的重要依據（圖2-3）。大多數細菌、酵母菌、以及許多真菌和單細胞藻類(lèi)能在固體培養基上形成孤立的菌落，采用適宜的平板分離法很容易得到純培養。所謂平板，即培養平板（culture plate）的簡(jiǎn)稱(chēng)，它是指固體培養基倒入無(wú)菌平皿，冷卻凝固后，盛固體培養基的平皿。這方法包括將單個(gè)微生物分離和固定在固體培養基表面或里面。固體培養基用瓊脂或其它凝膠物質(zhì)固化的培養基，每個(gè)孤立的活微生物體生長(cháng)、繁殖形成菌落，形成的菌落便于移植。最常用的分離、培養微生物的固體培養基是瓊脂固體培養基平板。這種由Kock建立的采用平板分離微生物純培養的技術(shù)簡(jiǎn)便易行，100多年來(lái)一直是各種菌種分離的最常用手段�！�
先將待分離的材料用無(wú)菌水作一系列的稀釋?zhuān)ㄈ?:10、1:100、1:1,000、1:10,000......），然后分別取不同稀釋液少許，與已熔化并冷卻至50℃左右的瓊脂培養基混合，搖勻后，傾入滅過(guò)菌的培養皿中，待瓊脂凝固后，制成可能含菌的瓊脂平板，保溫培養一定時(shí)間即可出現菌落。如果稀釋得當，在平板表面或瓊脂培養基中就可出現分散的單個(gè)菌落，這個(gè)菌落可能就是由一個(gè)細菌細胞繁殖形成的。隨后挑取該單個(gè)菌落，或重復以上操作數次，便可得到純培養�！�
由于將含菌材料先加到還較燙的培養基中再倒平板易造成某些熱敏感菌的死亡，而且采用稀釋倒平板法也會(huì )使一些嚴格好氧菌因被固定在瓊脂中間缺乏氧氣而影響其生長(cháng)，因此在微生物學(xué)研究中更常用的純種分離方法是涂布平板法。其做法是先將已熔化的培養基倒入無(wú)菌平皿，制成無(wú)菌平板，冷卻凝固后，將一定量的某一稀釋度的樣品懸液滴加在平板表面，再用無(wú)菌玻璃涂棒將菌液均勻分散至整個(gè)平板表面，經(jīng)培養后挑取單個(gè)菌落（圖2-4）。
用接種環(huán)以無(wú)菌操作沾取少許待分離的材料，在無(wú)菌平板表面進(jìn)行平行劃線(xiàn)、扇形劃線(xiàn)或其他形式的連續劃線(xiàn)（圖2-5），微生物細胞數量將隨著(zhù)劃線(xiàn)次數的增加而減少，并逐步分散開(kāi)來(lái)，如果劃線(xiàn)適宜的話(huà)，微生物能一一分散，經(jīng)培養后，可在平板表面得到單菌落�！�
4. 稀釋搖管法（dilution shake culture method）
用固體培養基分離嚴格厭氧菌有它特殊的地方。如果該微生物暴露于空氣中不立即死亡，可以采用通常的方法制備平板，然后置放在封閉的容器中培養，容器中的氧氣可采用化學(xué)、物理或生物的方法清除。對于那些對氧氣更為敏感的厭氧性微生物，純培養的分離則可采用稀釋搖管培養法進(jìn)行，它是稀釋倒平板法的一種變通形式* 。先將一系列盛無(wú)菌瓊脂培養基的試管加熱使瓊脂熔化后冷卻并保持在50℃左右，將待分離的材料用這些試管進(jìn)行梯度稀釋?zhuān)嚬苎杆贀u動(dòng)均勻，冷凝后，在瓊脂柱表面傾倒一層滅菌液體石蠟和固體石蠟的混合物，將培養基和空氣隔開(kāi)。培養后，菌落形成在瓊脂柱的中間（圖2-6）。進(jìn)行單菌落的挑取和移植，需先用一只滅菌針將液體石蠟--石蠟蓋取出，再用一只毛細管插入瓊脂和管壁之間，吹入無(wú)菌無(wú)氧氣體，將瓊脂柱吸出，置放在培養皿中，用無(wú)菌刀將瓊脂柱切成薄片進(jìn)行觀(guān)察和菌落的移植。
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