教學(xué)實(shí)驗室醫學(xué)真菌的保藏

醫學(xué)真菌作為自然界重要的生物資源，已成為微生物學(xué)實(shí)驗中不可或缺的基本材料，應用頻率較高。這其中部分為病原性真菌，而如何有效地保存保管好真菌菌種，以何種方式長(cháng)期穩定地保持其生物遺傳特性，則成為我們日常工作中需要研究探討的問(wèn)題。

　　1  材料與方法

　　1. 1     教學(xué)實(shí)驗室保存的菌種     (1)單細胞真菌：白色念珠菌、新生隱球菌。(2)多細胞真菌：黑曲霉菌、青霉菌、木霉菌。

　　1. 2     醫學(xué)真菌菌種的鑒定     菌種使用前，均需進(jìn)行形態(tài)學(xué)、生化學(xué)方面的鑒定，合格后方可使用。具體鑒定方法：(1)單細胞真菌：碳源發(fā)酵試驗、產(chǎn)子囊孢子及芽管試驗、咖啡酸試驗、尿素酶試驗；單細胞與多細胞真菌鑒定共用實(shí)驗：玉米粉吐溫80瓊脂小培養顯微鏡下觀(guān)察。(2)多細胞真菌：蛋白水解試驗、37℃生長(cháng)試驗、溫度試驗、PDA小培養實(shí)驗。

　　1. 3     真菌菌種的保藏方法     由于教學(xué)實(shí)驗各時(shí)期使用的真菌菌種在數量及種類(lèi)上不盡相同，所以與其相適應的培養方法與保管方式亦不相同。大體上分為定期傳代保存法、超低溫凍結保存法兩種。

　　1. 3. 1     定期傳代保存法     (1)液體培養基保存法：?jiǎn)渭毎�真菌接種于RPMI 1640培養基中,37℃培養24 h，取出后置4℃冰箱保存。該方法用于學(xué)期初低溫凍結菌種的復蘇、增菌培養。(2)瓊脂平板培養基保存法：學(xué)期開(kāi)始，多細胞凍結菌種解凍后，劃線(xiàn)接種于察氏平板培養基上面，28℃培養7～8  d，再將培養菌絡(luò )移種于改良馬丁平板培養基上，28℃培養7 d，待培養菌絡(luò )生長(cháng)良好,置4℃冰箱保存。為多細胞真菌的復蘇與鑒定試驗。(3)瓊脂斜面培養基保存法：?jiǎn)渭毎�真菌由液體培養基中多細胞真菌從馬丁培養基表面，分別挑取菌種菌絡(luò )，蜿蜒化線(xiàn)接種于各自相對應的瓊脂斜面培養基中,經(jīng)37℃或28℃培養生長(cháng)良好后，置4℃冰箱保存備用。該方法用于學(xué)期中，真菌菌種即將使用，實(shí)驗課前的菌種純化和制備階段。(4)液體石蠟覆蓋保存法：將無(wú)菌液體石蠟油覆蓋于菌絡(luò )生長(cháng)良好的瓊脂斜面真菌培養物表面，厚度約1 cm左右，置4℃冰箱保存。該法用于學(xué)期末對真菌菌種較長(cháng)時(shí)期的保存方法。

　　1. 3. 2     液氮超低溫凍結保存法     將單細胞或多細胞真菌培養物,以無(wú)菌生理鹽水洗下并計數，加入等量脫脂牛奶保護劑，分裝進(jìn)安瓿后封口。選擇菌種不同的適宜冷卻速度，使瓿內菌懸液急速或慢速凍結成冰。置液氮超低溫下保存。

  　2   結果

      2. 1     定期傳代保存法     (1)液體培養基保存法，可保存單細胞真菌15 d左右。(2)瓊脂平板培養基保存法，保存多細胞真菌15 d。(3)瓊脂斜面培養基保存法，保存單細胞、多細胞真菌1個(gè)月。(4)液體石蠟覆蓋保存法，可保存真菌菌種6個(gè)月。

　　2. 2     液氮超低溫凍結保存法     可保存凍結菌種1年。

　　3  小結
       
　　一般認為，傳代移種保存法保存的菌種，易失去病原性，而超低溫保存法能夠完整的保存菌種的致病性［１］。為此，我們針對實(shí)驗的初、中、末3個(gè)時(shí)期，對菌種的保存選擇不同的保存方法，優(yōu)化了菌種的遺傳特性不變性［２�玻常�。
           
　　實(shí)驗顯示，反復的移種傳代會(huì )使菌種的致病力和生理活性下降，孢子形成能力減弱，故超低溫凍結保存菌種，是最佳保藏菌種的方法，唯一不足的是菌種復蘇啟動(dòng)時(shí)間較長(cháng)。

【參考文獻】
［1］王家俊.臨床真菌檢驗［M］.上海：上海醫科大學(xué)出版社,1995:312.

［2］張卓然.醫學(xué)微生物實(shí)驗學(xué)［M］.2版.北京:科學(xué)出版社,2002:228��229.

［3］王 英.醫學(xué)微生物實(shí)驗室菌種的保存和保管［J］.海南醫學(xué)院學(xué)報,2006,12(1):57.

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