微生物快速檢測方法及應用進(jìn)展

【關(guān)鍵詞】  微生物快速檢測

隨著(zhù)人們生活水平不斷提高，各種安全問(wèn)題越來(lái)越受到人們的重視，微生物的污染問(wèn)題也相應地備受關(guān)注。在食品和環(huán)境等各個(gè)方面都有微生物污染的可能，一旦污染，微生物將大量繁殖而導致食源性疾病或環(huán)境污染甚至醫院內感染。特別是近年來(lái)隨著(zhù)環(huán)境污染的加劇和生態(tài)平衡的不斷破壞，導致感染的致病菌的種類(lèi)越來(lái)越多，病原微生物對人類(lèi)的威脅越來(lái)越大。傳統的檢驗方法，主要包括形態(tài)檢查和生化方法，其準確性、靈敏性均較高，但涉及的實(shí)驗較多、操作煩瑣、需要時(shí)間較長(cháng)、準備和收尾工作繁重，而且要有大量人員參與［1，2］。所以，迫切需要準確、省時(shí)、省力和省成本的快速檢驗方法。本文對微生物快速檢測方法的進(jìn)展情況及實(shí)際應用進(jìn)行綜述，以利于預防食源性疾病及公共衛生突發(fā)事件的發(fā)生。

    1  即用型紙片法

    　　3M公司的perrifilmTMPlate系列微生物測試片，可分別檢測菌落總數、大腸菌群計數、霉菌和酵母計數［3］。由RCP Scientific Inc 公司開(kāi)發(fā)上市的Regdigel系列，除上述項目外還有檢測乳桿菌、沙門(mén)氏菌、葡萄球菌的產(chǎn)品［4］，這兩個(gè)系列的產(chǎn)品與傳統檢測方法之間的相關(guān)性非常好。如用大腸菌群快檢紙片檢測餐具的表面，操作簡(jiǎn)便、快速、省料，特異性和敏感性與發(fā)酵法符合率高，已經(jīng)被列為國標方法。使用時(shí)應正確掌握操作技術(shù)和判斷標準，從而達到理想的檢測效果［5］。美國3M公司生產(chǎn)的PF(Petrifilm)試紙還加入了染色劑、顯色劑，增強了菌落的目視效果，而且避免了熱瓊脂法不適宜受損細菌恢復的缺陷。霉菌快速檢驗紙片，應用于食品檢驗中的霉菌具有操作簡(jiǎn)便，僅需36℃培養，不需要低溫設備；快速，僅需2 d就可觀(guān)察結果，比現在的國家標準檢驗方法縮短3～5 d，大大提高了工作效率。紙片法與國標法在霉菌檢出率上差異無(wú)統計學(xué)意義，且菌落典型，易判定。紙片熒光法利用細菌產(chǎn)生某些代謝酶或代謝產(chǎn)物的特點(diǎn)而建立的一種酶—底物反應法。只需檢測食品中大腸菌群、大腸桿菌的有關(guān)酶的活性，將熒光產(chǎn)物在365 nm紫外光下觀(guān)察即可。同時(shí)紙片可高壓滅菌處理，4℃保存，簡(jiǎn)化了實(shí)驗準備、操作和判斷［6］。但由于它們價(jià)格昂貴，限制了在基層單位的實(shí)際應用。

    2  生物化學(xué)技術(shù)

    2.1  PCR技術(shù)  PCR技術(shù)采用體外酶促反應合成特異性DNA片段，再通過(guò)擴增產(chǎn)物來(lái)識別細菌。由于PCR靈敏度高，理論上可以檢出一個(gè)細菌的拷貝基因，因此在細菌的檢測中只需短時(shí)間增菌甚至不增菌，即可通過(guò)PCR進(jìn)行篩選，節約了大量時(shí)間，但PCR技術(shù)也存在一些缺點(diǎn)：食物成分、增菌培養基成分和其他微生物DNA對Taq酶具有抑制作用，可能導致檢驗結果假陰性；操作過(guò)程要求嚴格，微量的外源性DNA進(jìn)入PCR后可以引起無(wú)限放大產(chǎn)生假陽(yáng)性結果，擴增過(guò)程中有一定的裝配誤差，會(huì )對結果產(chǎn)生影響。由于以上原因，PCR技術(shù)對操作者的自身素質(zhì)要求很高，對于基層單位而言難以做到。短時(shí)間內也不會(huì )有經(jīng)濟效益和社會(huì )效益，因此影響了這項技術(shù)在基層的應用。

    2.2  基因探針技術(shù)  基因探針技術(shù)利用具有同源性序列的核酸單鏈在適當條件下互補形成穩定的DNA�睷NA或DNA�睤NA鏈的原理，采用高度特異性基因片段制備基因探針來(lái)識別細菌�；�因探針的優(yōu)點(diǎn)是減少了基因片段長(cháng)度多態(tài)性所需要分析的條帶數。如法國生物一梅里埃公司的GEN�睵ROBE基因探針檢測系統，對于分離到的單個(gè)菌落，30 min完成微生物的確證試驗［7］，基因探針的缺點(diǎn)是不能鑒定目標菌以外的其他菌。

    3  選擇、鑒定用培養基法

    　　在培養基中加入特異性的生化反應底物、抗體、熒光反應底物、酶反應底物等，可使目標培養物的選擇、分離、鑒定一次性完成。如生物一梅里埃公司的BP+RPF(兔血漿+纖維蛋白原)培養基，可在24 h內鑒定金黃色葡萄球菌［8］。Merk公司的chro�瞞ocult Coliform Agar培養基上，大腸桿菌為墨綠色至紫色菌落，沙門(mén)菌為淡綠色至藍綠色菌落。檸檬酸桿菌和克雷伯桿菌為橙紅色至紅色菌落，其他腸道菌為無(wú)色菌落［9］。這個(gè)方法對操作者要求不高，短期培訓合格后即可上崗，從而取得一定的經(jīng)濟效益和社會(huì )效益，應用前景十分廣泛。

   4  免疫學(xué)技術(shù)

    免疫學(xué)技術(shù)通過(guò)抗原和抗體的特異性結合反應，再輔以免疫放大技術(shù)來(lái)鑒別細菌。免疫方法的優(yōu)點(diǎn)是樣品在進(jìn)行選擇性增菌后，不需分離，即可采用免疫技術(shù)進(jìn)行篩選。由于免疫法有較高靈敏度，樣品經(jīng)增菌后可在較短的時(shí)間內達到檢出度，抗原和抗體的結合反應可在很短時(shí)間內完成［10］。此技術(shù)對操作者要求也不高，是目前為止基層單位應用時(shí)間最長(cháng)最為廣泛的一項快速檢測技術(shù)。如采用免疫磁珠法可有效地收集、濃縮神奈川現象陽(yáng)性的副溶血性弧菌，可顯著(zhù)提高環(huán)境樣品及食品中病原性副溶血性弧菌的檢出率［11］。膠體金免疫層析法能快速、靈敏檢測金黃色葡萄球菌［12］，應用膠體金免疫層析法檢測乙型肝炎表面抗原，可大大提高工作效率［13］。ATP生物發(fā)光法是近年發(fā)展較快的一種用于食品生產(chǎn)加工設備潔凈度檢測的快速檢測方法。利用ATP生物發(fā)光分析技術(shù)和體細胞清除技術(shù)，測量細菌ATP和體細胞ATP， 細菌ATP的量與細菌數成正比，用ATP生物發(fā)光分析技術(shù)檢測肉類(lèi)食品細菌污染狀況或食品器具的現場(chǎng)衛生學(xué)檢測，都能夠達到快速適時(shí)的目標［14，15］。微型自動(dòng)熒光酶標分析法(mini VIDAS)是利用酶聯(lián)熒光免疫分析技術(shù)，通過(guò)抗原-抗體特異反應，分離出目標菌，由特殊儀器根據熒光的強弱自動(dòng)判斷樣品的陽(yáng)性或陰性。VIDAS法檢測凍肉中沙門(mén)菌具有很高的靈敏度和特異性，用于進(jìn)出口凍肉的檢測，可大大縮短檢驗時(shí)間，加快通關(guān)速度［16］，檢測凍肉中李斯特氏菌亦如此［17］。

    5  細菌直接計數法

    主要包括流式細胞儀(flow cytometry，FCM)和固相細胞計數(solid phase cytometry，SPC)法。FCM通常以激光作為發(fā)光源，經(jīng)過(guò)聚焦整形后的光束垂直照射在樣品流上，被熒光染色的細胞在激光束的照射下產(chǎn)生散射光和激發(fā)熒光。光散射信號基本上反映了細胞體積的大��；熒光信號的強度則代表了所測細胞膜表面抗原的強度或其核內物質(zhì)的濃度，由此可通過(guò)儀器檢測散射光信號和熒光信號來(lái)估計微生物的大小、形狀和數量。流式細胞計數具有高度的敏感性，可同時(shí)對目的菌進(jìn)行定性和定量鑒定［18］。目前已經(jīng)建立了細菌總數［19］、致病性沙門(mén)菌、大腸埃希氏菌［20］等的FCM檢驗方法。固相細胞計數可以在單個(gè)細胞水平對細菌進(jìn)行快速檢測［21］。濾過(guò)樣品后，存留的微生物在濾膜上進(jìn)行熒光標記，采用激光掃描設備自動(dòng)計數。每個(gè)熒光點(diǎn)可直觀(guān)地由通過(guò)計算機驅動(dòng)的流動(dòng)臺連接到ChemScan上的落射熒光顯微鏡來(lái)檢測，尤其對于生長(cháng)緩慢的微生物檢測用時(shí)短，使該方法明顯優(yōu)于傳統平板計數法［22］。此方法要求配備特殊的儀器，財政投入較大，因此基層單位目前暫時(shí)無(wú)法應用。

    6  全自動(dòng)微生物分析系統(AMS)

    AMS是一種由傳統生化反應及微生物檢測技術(shù)與現代計算機技術(shù)相結合，運用概率最大近似值模型法進(jìn)行自動(dòng)微生物檢測的技術(shù)，可鑒定由環(huán)境、原料及產(chǎn)品中分離的微生物。AMS僅需4～18 h即可報告結果，以常規法鑒定細菌，只能得到是或不是某種菌，要想知到是哪種菌還要做大量、煩瑣的生化試驗，而AMS則可以直接報告是什么菌［23］。法國生物梅里埃集團公司出品的Vitek�睞MS自動(dòng)微生物檢測系統屬當今世界上最為先進(jìn)、自動(dòng)化程度最高的細菌鑒定儀器之一。Vitek對細菌的鑒定是以每種細菌的微量生化反應為基礎，不同種類(lèi)的Vitek試卡(檢測卡)含有多種的生化反應孔，可達30種，可鑒定405種細菌［24］。用AMS明顯縮短腸道菌生化鑒定的時(shí)間，如鑒定沙門(mén)菌屬只需4 h，鑒定志賀氏菌屬只需6 h，鑒定霍亂弧菌等致病性弧菌亦只需4～13 h［22］183-186。這套系統對基層單位而言具有極強的應用價(jià)值，但他昂貴的價(jià)格讓人望而生畏。

    總之，隨著(zhù)現代科技的發(fā)展，可以預料在不遠的將來(lái)，傳統的微生物檢測技術(shù)將逐漸被各種新型簡(jiǎn)便的微生物快速診斷技術(shù)所取代。近年來(lái)興起的基因探針技術(shù)及全自動(dòng)微生物檢測系統，將從根本上改變微生物的檢測方法，具有非常廣闊的應用前景。

【參考文獻】
  ［1］ 唐靈，郭奕芳，吳翊，等.Petrifilm紙片法和國際法檢測奶制品細菌總數和大腸菌群數的結果比較［J］. 中國衛生檢驗雜志，2000,10(3):325-327.

［2］ 吳清平，周艷紅，蔡芷荷.衛生微生物特異性顯色培養基的研究與應用［J］.中國衛生檢驗雜志，2005,15(1):124-126.

［3］ Townsend D E．Comparison of the simplate coliform and escherichia coli test with pertrifilm，there tube MPN，and VRBA+MUG methods for enumeratlng coiiforms and Ecoli in food［J］．J Food Protection，1998，61(4)：444-449．

［4］ 闞方琦，董非，李華，等．兩種大腸菌群快檢紙片的質(zhì)量檢測及應用效果比較［J］．預防醫學(xué)文獻信息，2003，9(2)：167-168．

［5］ 汪琦．食品中霉菌檢測兩種方法的比較［J］．中國誤診學(xué)雜志，2004，4(4)：617-618．

［6］ 劉秀鋒，潘珍瑜，劉紅，等．應用霉菌檢測紙片快速檢測食品霉菌的研究［J］．廣西預防醫學(xué)，2001，7(2)：99-100．

［7］ 時(shí)煒．產(chǎn)單核細胞李氏菌在食品中的研究近況［J］．中國衛生檢驗雜志，2003，13(1)：122.

［8］ 陳燦卿．現代食品衛生學(xué)［M］．北京：人民衛生出版社，2002：124．

［9］ Turner KM．Efficacy of chromocult coliform agar for coliform and escherichia coil detection in foods［J］．J Food Port，2002，63(4)：539-547.

［10］ Vialette M，Pinon A，Leporq B, et al．Meta�瞐nalysis of food safety information based on a combination of a relational database and a predictive modeling tool［J］．Risk Anal，2005，25(1)：75-83．

［11］ 張凡非.副溶血性弧菌及其引起的食物中毒檢驗研究進(jìn)展［J］.中國衛生監督雜志，2003，10（1）：8.

［12］ 杜玉萍，陳清，王雅賢，等.膠體金免疫層析法檢測金黃色葡萄球菌的初步研究［J］.熱帶醫學(xué)雜志，2006，6（6）：650.

［13］ 莊輝．乙型肝炎表面抗原（HBsAg）膠體金試劑的研制［J］．中國公共衛生，2001,17(4)：300-301.

［14］ 曹利蓉，張偉，晁蕊．ATP生物發(fā)光法在鐵路站車(chē)食品器具衛生學(xué)檢驗中的應用［J］．鐵道勞動(dòng)安全衛生與環(huán)保，2004，31(2)：86-87．

［15］ 舒柏華，孫丹陵，王勝利，等．肉類(lèi)食品細菌污染生物發(fā)光快速分析技術(shù)研究［J］．中國公共衛生，2003，19(4)：483-484．

［16］ 陳思強，鐘偉強，曾振興，等.自動(dòng)酶聯(lián)熒光免疫分析系統檢測凍肉中沙門(mén)菌的評價(jià)［J］．中國國境衛生檢疫雜志，2004，27(5)：309.

［17］ 孫素霞，陳思強，羅海吉.自動(dòng)酶聯(lián)熒光免役分析系統檢測凍肉中李斯特氏菌［J］.南方醫科大學(xué)學(xué)報，2006，26（9）：1325.

［18］ Gunasekera TS,Veal DA，Attfield PV．Potential for broad applications of flow cytometry and fluorescence techniques in microbiological and somatic cell analyses of milk［J］．Int J Food Microbiol，2003，85(3)：269-279．

［19］ Gunasekera TS,Attfield PV,Veal DA.A flow cytometry method for rapid detection and enumeration of total bacteria in milk［J］．Appl Environ Microbiol，2000，66(3)：1228-1232．

［20］ Fuchs BM，Wallner G,Beisker W, et al．Flow cytometric analysis of the in situ accessibility of Escherichia coli 16S rRNA for fluorescently labeled oligonucleotide probes［J］．Appl Environ Microbiol，1998，64(12)：4973-4982．

［21］ Lisle JT,Hamilton MA，Willse AR，et al．Comparison of fluorescence microscopy and solid�瞤hase cytometry methods for counting bacteria in water［J］．Appl Environ Microbiol,2004,70(9)：5343-5348．

［22］ 王曉英．固相細胞計數法一種快速檢測單細胞細菌的食品微生物新檢測方法［J］．國外醫學(xué)衛生學(xué)分冊，2003，30(3)：183-186．

［23］ 李丹紅.全自動(dòng)微生物分析系統在衛生防病檢測鑒定中的應用［J］．口岸衛生控制，2000，5(3)：42-43.

［24］ 楊毓環(huán)，陳偉偉．VITEK全自動(dòng)微生物檢測系統原理及其應用［J］．海峽預防醫學(xué)雜志，2000，6(3)：38-39

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