大腸桿菌質(zhì)粒DNA的提�。▔A裂解法）

大腸桿菌質(zhì)粒DNA的提�。▔A裂解法）

此方法適用于小量質(zhì)粒DNA的提取提取的質(zhì)粒DNA可直接用于酶切PCR擴增。

1 ).    取1.5ml細菌培養物于EP管中，4000rpm離心1分鐘，棄上清液，使細菌沉淀盡量干燥；

2 ).    將細菌沉淀重懸于用冰預冷的100 µl溶液I (50 mmol/L葡萄糖，10 mmol/L EDTA pH 8.0，25 mmol/L Tris-HCl pH 8.0) 中，劇烈振蕩；

3 ).    加入200 µl新配制的溶液II(0.2 mol/L NaOH，1％SDS（m/v）)，蓋緊EP管口，快速顛倒離心管5次，以混合混合物，確保離心管的整個(gè)內表面與溶液II接觸，不要渦旋，置于冰浴中；

4 ).    加入150 µl預冷溶液III(每100 ml 的溶液III中含60 ml 5 mol/L 乙酸鉀，11.5 ml冰乙酸，28.5 ml H₂O)，蓋緊EP管口，反復顛倒數次，使溶液III在粘稠的細菌裂解物中分散均勻，之后將管置于冰上3~5分鐘；

5 ).    在最大轉速下離心5min，取上清液于另一新EP管；

6 ).    用兩倍體積的乙醇室溫沉淀雙鏈DNA，振蕩混合于室溫放置2分鐘，最大轉速離心5分鐘；

7 ).    小心吸去上清液，將離心管倒置于濾紙上，以使所有液體都流出，在將附于管壁的液滴除盡；

8 ).    加1ml 70％乙醇洗滌沉淀，振蕩混合，用12,000g離心2分鐘，棄上清，將開(kāi)口的EP管置于室溫使乙醇揮發(fā)，直至EP管中內沒(méi)有可見(jiàn)的液體存在（5～10分鐘），用適量的ddH₂O溶解；

9 ).    用0.5µl的RNase 37℃溫育5~10分鐘；

10 ).     電泳鑒定。