中量提取質(zhì)粒DNA（CsCl 密度梯度離心法）

中量提取質(zhì)粒DNA（CsCl 密度梯度離心法）
李淵越
1. 將菌液倒入裝有 50mL TB 的錐形瓶中，或從培養好的平板上挑取單克隆，錐形瓶置于37℃搖床
350rpm 培養16-20h,至OD600 到10-12。（OD600 到40 為用TBS 培養基在我們的培養條件下所能達到的最高濃度，
在此濃度時(shí)，菌處于對數生長(cháng)期）
2. 將培養好的菌液到入國產(chǎn) 50mL 離心管中，每管不超過(guò)45mL。（有實(shí)驗表明，若往離心管中裝入超過(guò)45mL 的
液體，離心后，液體的終體積仍為45mL。因此，一次不應離超過(guò)45mL 的液體，否則將污染離心機。）
3. 室溫離心 5,000rpm，5min。棄上清，控干。
4. 加 P1-RNase 至終體積到7mL，震蕩重懸至菌均勻分散。（按該法最多只能裂解45mL 13OD 的細菌，如需裂解更
多細菌，請按比例增加。否則將導致細菌裂解不完全，反而提到更少的菌。）
5. 加 14mL P2，蓋上蓋子，上下顛倒混勻2min。（該步一定要混勻，以達到將細菌完全裂解的目的。加入P2 后可見(jiàn)溶
液澄清粘稠，該步反應時(shí)間不應過(guò)久）
6. 加 7mL P3。（P2 和P3 之間反應時(shí)間不要超過(guò)5min�；靹蚝罂梢�(jiàn)絮狀沉淀。該步若置于冰上，沉淀效果更好。但位于室溫的反應
以足以達到實(shí)驗需要。）用H2O 配平至對稱(chēng)管重量差<0.1g。
7. 室溫（4 度更好，但沒(méi)有必要。）離心，10,000 rpm, 5min。
8. 將上清用濾紙過(guò)濾至另一國產(chǎn)的 50mL 管中。加0.6 倍體積的異丙醇，顛倒混勻后室溫（不可置于
4 度。若置于4 度，將會(huì )使部分鹽析出）靜置10min。（分子克隆p35）
9. 室溫離心 10,000rpm 15min。
10. 棄上清，在加 1.8mL H2O 溶解完全后，平均分至兩個(gè)1.5mL 管中，再分別往每管中加入二分之
一體積的PEG8000，4C 沉淀2 小時(shí)。
11. 3,000 rcf 離心3min，棄上清。（可以不要非常完全控干）
12. 加 1.55mL CsCl 溶液溶解至沉淀完全溶解。10,000 rcf 3min 離心，棄去不溶物質(zhì)。
13. 往 2mL 超速離心管中加入50ul 2mg/mL EB。加之前用卷紙把槍頭外壁的EB 擦干。（將外壁的EB 擦干
是為了防止EB 殘留在離心管的管口。）
14. 將 DNA 移至2mL 超速離心管中,并用H2O 將體積補至2mL。（此時(shí)，溶液的密度為3.10g/2mL，共含1.55g CsCl。）
15. 配平至對稱(chēng)管重量差<0.02g，封口。（該步配平時(shí)，可按1ulH2O 重0.001g 來(lái)補加H2O 進(jìn)行配平以縮短時(shí)間。）在封口
后，上下顛倒混勻。
16. 打開(kāi)超速離心機，按 Memu -> Programme -> Plasmid-CsCl -> OK。（該步為149,000rpm 2h 升速max 降速
6。）
17. 按 Vacuum 至真空度<400 后按 Start。（不等真空度至<400 其實(shí)也可啟動(dòng)，但這可能將造成離心機反復升降速，故制
定此規則。）等升至最大轉速后才能離開(kāi)。（該步為離心機安全操作必須，請務(wù)必做到。）
18. 2h 后，取出轉頭，離心管。若轉頭內有液體需將其洗凈，擦干。（因為此時(shí)泄漏的液體含有EB，因此需要
將其洗凈，擦干。）
19. 先用 8 號針頭在離心管上部插個(gè)洞，再用1mL 注射器抽出所需的紅色DNA 條帶至1.5mL 離心管
中。
20. 加入 1mL 水飽和正丁醇，上下顛倒混勻（勿用振蕩器）約20 下。（或更多，使上部液體盡可能變紅。）將
1.5mL 管置于離心機中，按Short 鍵 5 秒，松手。棄去上層液體。（離心的目的是為了加速液面分層，因此
也可省去。）
21. 重復 20 步2-3 遍，至下層看不到紅色后再萃取一遍。（再萃取一遍的目的是為了確保EB 完全去除。）
22. 往溶液中補加等體積的 H2O，平均分成若干管，使每管終體積為400ul。往每管中分別加入1mL(2.5
倍體積)無(wú)水乙醇，顛倒混勻。13,500 rpm 5min 4C。棄上清。（該步的目的是為了除去溶液中殘留的CsCl。）
23. 加 1mL 預冷的70%乙醇洗一遍。13,500 rpm 5min 4C。棄上清。（該步的目的是為了除去21 步中管壁上殘留
的部分含CsCl 的液體。）
24. 加 400ul H2O 或TE 溶解。（對于高拷貝質(zhì)粒，45mL 菌液將獲得500-1,500ug 左右質(zhì)粒。）
中量提取質(zhì)粒DNA（CsCl 密度梯度離心法）
試劑
P1
50mL P1+5mg RNase，4C 保存。
P2
P3
異丙醇
PEG8000
CsCl 溶液
準確稱(chēng)取31.00gCsCl，加H2O 定容至30.0mL。
2mg/mL EB
水飽和正丁醇
無(wú)水乙醇
70%乙醇

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