大量提取質(zhì)粒DNA（CsCl 密度梯度離心法）
錄入時(shí)間:2011-9-8 17:06:35
來(lái)源：生物在線(xiàn)
大量提取質(zhì)粒DNA（CsCl 密度梯度離心法）
李淵越
1. 預約搖床、超速離心機。
2. 配 TB 培養基（1L 錐形瓶中裝250 ml 培養液），并滅菌。質(zhì)粒做好轉化，并涂板。
3. 第一天早上，往 TB 中加入適量的Amp 或Kana。挑菌，37 ℃搖床培養 24 h，至OD600 到10-15。
4. 檢查以下藥品：25％ sucrose in 50 mM Tris-HCl（pH8.0）>250mL、lysozyme 粉末>1g、0.5 M EDTA
（pH8.0）>50mL、RNase A（100 mg/ml）>150uL、Triton-lysis>100mL、PEG8000>300mL、1×TE>150mL、
CsCl>250g、正丁醇>2 瓶、EB>2mL。
5. 第二天早上，把菌液倒入離心瓶中，用 Beckman J6-MI 離心機以4,200 rpm, 20 min 離心。離心后，把
上清倒干。在離心的時(shí)候，配Lysozyme 25mL。并將RNase 置于室溫。
6. 棄上清，以 20ml 25％ sucrose in 50 mM Tris-HCl（pH8.0），重懸至菌完全分散。
7. 加入 4ml 新配制的lysozyme-EDTA-RNase 溶液�；靹�，室溫靜置10 min 以上。
8. 在靜置的同時(shí)，準備好高速離心管，往里面各加入 5ml Triton-lysis。
9. 將 lysozyme-EDTA-RNase-DNA 溶液倒入高速離心管中，使用JA-30.50 Ti 轉頭，100,000g, 15min。
10. 將上清倒入新管中（不要把沉淀倒出來(lái)），加入PEG8000 使總體積至50mL（1/2 體積），顛倒混勻，
于4 ℃中放置2 h 以上（過(guò)夜更好）。
11. 4,000 g 5 min，去上清，加入8.5ml TE，溶解至無(wú)沉淀。
12. 加入 11.00 g（要精確到小數點(diǎn)后2 位，便于配平）CsCl，溶解完全。
13. 在超離管中用 200ul 槍加入100ul EB（2mg/ml），將溶液通過(guò)20mL 一次性注射器移入超離管中，用
TE 將液面補平至近管口。
14. 補加 TE 至液面到超速離心管管口。
15. 稱(chēng)出每管重量，配平，封口。任選以下一種條件在 20℃下進(jìn)行密度梯度離心：
轉頭 轉速 時(shí)間
Type 70.1 Ti 70,000rpm 20h
NVT65 60,000rpm 16h
NVT65 65,000rpm 8h
16. 滅 250mL 以上的超純水，并配好至少500mL 滅菌水飽和正丁醇。
17. 超離后，取樣品，用5 ml 注射器加上12#針頭，抽取EB 帶，（離心完可見(jiàn)兩條EB 帶，上面一條細淺
的帶為斷裂的質(zhì)粒DNA,應抽取下面一條粗濃的EB 帶）放入50ml 管中。
18. 以滅菌水飽和正丁醇溶液萃取 EB，直到溶液澄清無(wú)色。
19. 加入等體積 TE（一定要加。若不加，在無(wú)水乙醇沉淀時(shí)，會(huì )沉淀下部分CsCl）。
20. 加入 2 倍體積預冷的無(wú)水乙醇，混勻（如果不充分混勻，可能會(huì )導致離下的DNA 是透明的，容易隨
上清一起倒掉）。6,000rpm，20min，（注意方向）去上清（注意沉淀不會(huì )貼壁，不要倒掉）。
21. 加入 450 μl (~900ul)水，把50mL 離心管平放（注意方向），溶解，直到溶解完全（約需室溫過(guò)夜）。
22. 用槍小心將液體吸入 1.5mL 離心管中（如>450ul，可分成兩管），加入十分之一體積的3 M NaAc (pH
5.2)，再加入2 倍體積預冷的無(wú)水乙醇，混勻，置于4C 或-20C 15-30min。13,000 rpm 離心10min。
23. 用 1mL 70%預冷的乙醇洗沉淀一次，13,000rpm 離心10min。
24. 去上清，以 1mL TE 溶解完全，測定濃度。
大量提取質(zhì)粒DNA（CsCl 密度梯度離心法） 2010-7-7
lysozyme-EDTA-RNase 溶液
溶菌酶 0.4 g
0.5M EDTA (pH=8.0) 25mL
RNase A (100mg/mL) 120uL
H2O 25mL
25％ 蔗糖:
蔗糖 25 g
1 M Tris-HCl（pH 8.0） 5 ml
過(guò)濾，加純水定容至100 ml，置于4 ℃保存。
0.5 M EDTA（pH 8.0）:
EDTA·Na·2H2O 186.1 g
NaOH 約20 g
加800 ml 純水溶解完全后，調pH 至8.0，定容至1 L，濕熱滅菌，常溫保存。
Triton-lysis:
10% Triton-100 5mL
1 M Tris-HCl（pH 8.0） 15 mL
H2O 100mL
濕熱滅菌，常溫保存。
PEG8000：
PEG8000 150 g
5 M NaCl 150 ml
加純水定容至500 ml，濕熱滅菌，常溫保存。
EB（2mg/ml）：
EB 20mg
加超純水10ml，溶解，室溫保存。
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