分子伴侶
目前已經(jīng)達成共識，有效的蛋白質(zhì)翻譯后折疊、多肽裝配成寡聚體結構以及蛋白質(zhì)的轉位都是由一種被稱(chēng)為分子伴侶的專(zhuān)職蛋白來(lái)介導的[200]。原核生物的核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶在E.coli中的有效合成和裝配需要GroES和GroEL蛋白的證據，使得利用分子伴侶在E.coli中進(jìn)行基因高效表達成為近來(lái)研究的熱點(diǎn)[201]。但是，利用分子伴侶所得到的實(shí)驗結果并不一致，而且迄今為止，伴侶分子的共表達對基因表達的影響似乎都具有蛋白質(zhì)特異性[202]。目前尚不清楚在基因過(guò)度表達的情況下，分子伴侶的體內水平是否受到限制。正常情況下，蛋白質(zhì)的折疊最終達到一種熱力學(xué)的穩定狀態(tài)。特別不穩定的蛋白即使在伴侶分子存在的情況下，或許也不能正確折疊。因此，多肽鏈的截斷、多亞基蛋白復合物單個(gè)結構域的產(chǎn)生、缺乏維持蛋白質(zhì)正常結構的二硫鍵的形成以及缺乏翻譯后的修飾如糖基化等，都將不可能達到熱力學(xué)的穩定狀態(tài)�，F在已經(jīng)明白不同類(lèi)型的伴侶分子正常情況下是協(xié)同發(fā)揮作用的[203]。因此，只過(guò)度表達單一的伴侶分子可能不太有效。在某些情況下，共表達與靶蛋白來(lái)源相同的伴侶分子可能是必要的。還有一個(gè)需要考慮的變量是培養溫度。例如，在30℃時(shí)GroES-GroEL共表達能夠提高β-半乳糖苷酶的產(chǎn)量，而在37℃或42℃則不能[204]。最后，伴侶分子的共表達有可能導致表型的改變如細菌絲狀生長(cháng)，這有可能對細菌的生存和蛋白質(zhì)的產(chǎn)生不利[205]。最近有報道表明，將人或鼠的蛋白質(zhì)二硫鍵異構酶（PDI）與靶基因共表達，能提高在E.coli細胞質(zhì)中正確折疊蛋白質(zhì)的產(chǎn)量[206，207]。E.coli細胞質(zhì)中二硫鍵的形成是由維持氧化還原電勢的一組蛋白質(zhì)來(lái)促進(jìn)的[208]。有人認為DsbA（一種可溶性的細胞外周質(zhì)蛋白）直接催化蛋白質(zhì)中二硫鍵的形成，而DsbB（一種內膜蛋白）則參與DsbA的再氧化。真核生物的PDI能夠補充dsbA缺失突變株的表型，但其功能在dsbB突變株中完全喪失。另外，通過(guò)額外添加谷胱甘肽可以提高PDI增強靶蛋白產(chǎn)生的能力。這些證據表明，PDI有賴(lài)于細菌氧還蛋白來(lái)完成自身的再氧化[207]。
培養條件
E.coli中的蛋白質(zhì)產(chǎn)量可以通過(guò)高細胞密度培養系統而獲得顯著(zhù)提高。高細胞密度培養系統可以分成三類(lèi)：分批培養、補料分批培養和連續培養。這些方法能獲得超過(guò)100g/升的細胞濃度，從而獲得廉價(jià)的重組蛋白。有關(guān)大規模培養系統的資料已有詳細的綜述[193，209]。培養基的組成需要仔細地計算和監控，因為這對細胞和蛋白質(zhì)的產(chǎn)生具有重要的代謝效應。例如，不同mRNA的翻譯可以因溫度和培養基的變化而受到不同程度的影響[210]。營(yíng)養成分和培養參數如pH、溫度和其他參數都會(huì )影響蛋白酶的活性、分泌和產(chǎn)量[211]。已經(jīng)證明對培養基的特殊操作能明顯提高蛋白質(zhì)釋放到培養基中。例如，在培養基中添加甘氨酸能增強外周質(zhì)蛋白釋放到培養基中，且不引起明顯的細菌裂解[212，213]。同樣，在山梨糖醇和甘氨酰甜菜堿存在的滲透壓力下培養細菌，可以使可溶性的活性蛋白產(chǎn)量提高多達400倍[139]。
高細胞密度培養系統也有其自身的缺陷。這些缺陷包括在高細胞密度情況下，溶解氧的量有限；二氧化碳水平能夠降低生長(cháng)速度、刺激乙酸形成降低發(fā)酵罐的混合效率和產(chǎn)熱等。有關(guān)這些問(wèn)題的解決方案已經(jīng)有詳細的介紹[193]。利用高細胞密度培養系統生產(chǎn)重組蛋白質(zhì)的一個(gè)主要問(wèn)題是乙酸的積累，這種親脂性成分對細胞的生長(cháng)是有害的[193]。雖然有多種解決這一問(wèn)題的方案，但是均各有缺點(diǎn)。近來(lái)這一問(wèn)題通過(guò)將來(lái)自B. subtilis編碼醋酸鹽合成酶的alsS基因導入E.coli細胞中得以解決[141]。該酶催化丙酮酸轉化為非酸性和低毒性的副產(chǎn)品。乙酸積累的減少極大地改善了重組蛋白的產(chǎn)生。另外，其他酶缺陷的E.coli突變株也已經(jīng)建立，這些突變株產(chǎn)生較少的乙酸，從而提高了人重組蛋白的表達水平[214]。
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