密碼子的使用
原核和真核生物的基因對同義密碼子的使用均表現非隨機性[171，172]。對E.coli中密碼子的使用頻率進(jìn)行系統分析得到以下結論[173]：（1）對于絕大多數的簡(jiǎn)并密碼子中的一個(gè)或兩個(gè)具有偏好；（2）某些密碼子對所有不同的基因都是最常用的，無(wú)論蛋白質(zhì)的含量多少，例如CCG是脯氨酸最常用的密碼子；（3）高度表達的基因比低表達的基因表現更大程度的密碼子偏好；（4）同義密碼子的使用頻率與相應的tRNA含量有高度相關(guān)性。這些結果暗示,富含E.coli不常用密碼子（表1）的外源基因有可能在E.coli中得不到有效表達。已經(jīng)證明[174]，微精氨酸tRNAArg(AGG/AGA)是多種哺乳動(dòng)物基因在細菌中表達的限制因子。因為AGA和AGG在E.coli中不常用。如果共表達編碼tRNAArg(AGG/AGA)的argU(dnaY)基因，就會(huì )高水平表達目的蛋白[174]。但利用同方法所進(jìn)行的另外幾項研究的結果卻不一致[175，176]。其他的研究表明,通過(guò)用常用密碼子替換稀有密碼子或與“稀有”tRNA基因共表達可以提高外源基因在E.coli中的表達水平[177，178]。許多研究者對有關(guān)密碼子使用模式的進(jìn)化意義和密碼子使用效果的機制進(jìn)行了研究，但至今尚未找到協(xié)調密碼子的使用和轉錄本翻譯的精確規則。似乎在轉錄本5’末端附近存在稀有密碼子將會(huì )影響翻譯效率。另外，基因5’編碼區中GC含量似乎也影響其表達。這在人胸苷酸激酶（TS）中已經(jīng)得到證明[179]。在不改變所編碼蛋白的前提下，將TS cDNA的第三、四、五密碼子的嘌呤堿基變成胸腺嘧啶，使得TS基因的表達占到E.coli中總蛋白量的25-30%。綜上所述，有許多可變因素可能影響實(shí)驗結果，如位置效應、稀有密碼子的群集和mRNA的二級結構等等。
表1 E.coli中不常用的密碼子
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密碼子 氨基酸 |
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AGA,AGG,CGA,CGG Arg
UGU,UGC Cys
AUA Ile
CUA,CUC Leu
CCC,CCU,CCA Pro
UCA,AGU,UCG,UCC Ser
ACA Thr |
l 蛋白質(zhì)的蛋白酶解
蛋白酶解是一個(gè)選擇性的、高度調節的過(guò)程，該過(guò)程參與許多代謝活動(dòng)。E.coli在細胞質(zhì)、細胞外周質(zhì)、內膜和外膜有許多蛋白酶[180，181]。這些蛋白酶參與宿主的代謝活動(dòng)，如選擇性地清除異常和錯誤折疊的蛋白。到目前為止，蛋白酶解的機制尚未完全明了，但已有一些策略和方法以減少E.coli中異源蛋白的降解。雖然使得蛋白質(zhì)不穩定的精確結構特點(diǎn)還不清楚，但是通過(guò)系統研究已經(jīng)明確了一些蛋白不穩定的決定因素。蛋白酶解途徑的“N-末端規則”在E.coli中能夠發(fā)揮作用，即蛋白質(zhì)的穩定性與其氨基端的殘基有關(guān)[182]。在E.coli中，Ｎ－末端Arg、Lys、Leu、Phe、Tyr和Trp的半衰期為２分鐘，而除脯氨酸外的其他氨基酸的半衰期均超過(guò)10小時(shí)。有研究表明，在多肽的第二位帶有較小側鏈的氨基酸有利于甲硫氨酸氨肽酶催化的N-末端甲硫氨酸的去除，從而暴露出位于第二位的亮氨酸，使得該蛋白不穩定[183]。蛋白質(zhì)的第二個(gè)決定因素是位于近氨基端的特異性?xún)仍促?lài)氨酸殘基[142，143]。該殘基是多遍在蛋白鏈的受體，多遍在蛋白鏈在真核細胞中有利于遍在蛋白依賴(lài)的蛋白酶對蛋白質(zhì)的降解。有趣的是在一個(gè)多遍在蛋白中，它的兩個(gè)決定簇可以位于不同的亞基上，卻能靶向同一個(gè)蛋白進(jìn)行加工[184]。 氨基酸成分和蛋白質(zhì)不穩定性的另一個(gè)關(guān)系體現在PEST假說(shuō)中[185]。根據對短壽命真核蛋白的統計分析，蛋白質(zhì)如果富含Pro、Glu、Ser和Thr的區域，且在該區域附近有某些特定的氨基酸，則該蛋白就會(huì )不穩定。這些PEST結構域的磷酸化導致鈣的結合能力提高，從而利于鈣依賴(lài)性蛋白酶對蛋白質(zhì)的降解。這提示可以在缺乏PEST蛋白裂解系統的E.coli中表達PEST富含蛋白。
減少E.coli中重組蛋白裂解的策略有以下幾種：（1）將蛋白質(zhì)靶向細胞周質(zhì)或培養基[145，186]；（2）在較低的溫度下培養細菌[187]；（3）選用蛋白酶缺陷的菌株[188]；（4）構建N-末端或C-末端融合蛋白[186]；（5）將目的基因多拷貝串聯(lián)[188]；（6）與分子伴侶共表達[189]；（7）與T4 pin基因共表達[190]；（8）替換特定的氨基酸殘基以消除蛋白酶裂解位點(diǎn)[191]；（9）改善蛋白質(zhì)的親水性[192]；（10）優(yōu)化培養條件[193]
融合蛋白表達
在E.coli中表達外源蛋白，尤其是真核蛋白時(shí)，蛋白質(zhì)的穩定性是經(jīng)常遇到的問(wèn)題。最近幾年，眾多巧妙的蛋白質(zhì)——融合系統的發(fā)展，為E.coli中高效表達和純化重組蛋白提供了極大方便。融合表達具有多方面的優(yōu)點(diǎn)：如防止包涵體的形成，促進(jìn)蛋白質(zhì)的正確折疊，限制蛋白酶解和利于純化[159，194]。
Uhlen和其同事[195]利用葡萄球菌A蛋白和合成的結構域（Z）開(kāi)發(fā)了一種多功能的融合伴侶，除了能夠作為純化標記外，A蛋白組分還作為一種可溶性伴侶促進(jìn)蛋白質(zhì)的折疊，A蛋白信號肽的存在可使表達蛋白分泌到培養基中。另一個(gè)融合伴侶是鏈球菌G蛋白（SPG），它是一種細菌胞壁蛋白，在其氨基端具有分離的白蛋白結合區，在OH端具有免疫球蛋白IgG結合區[196]。最小的白蛋白結合區由來(lái)源于SPG的46個(gè)氨基酸殘基組成，作為親和純化標記純化cDNA編碼的蛋白。如果將A蛋白和SPG結構域聯(lián)合組成三聯(lián)融合蛋白，則為純化提供了更為廣泛的選擇，可以更進(jìn)一步防止蛋白酶解。SPG-白蛋白的一個(gè)重要應用是其能夠穩定哺乳動(dòng)物外周循環(huán)中的短壽命蛋白，這一效應是通過(guò)SPG結構域與一種長(cháng)壽命蛋白——血清白蛋白的結合來(lái)介導的[197]。
最近又建立了一種更為復雜和巧妙的親和系統[198]。這種多元系統利用了七種不同的親和標記，從而允許使用多種結合和洗脫條件，為重組蛋白的生產(chǎn)、檢測和純化提供了一個(gè)有力的工具。
使用基因融合表達系統在E.coli中表達外源基因已經(jīng)越來(lái)越受歡迎。這在很大程度上歸因于融合系統能夠產(chǎn)生大量的可溶性的融合蛋白。谷胱甘肽Ｓ－轉移酶（GST）、麥芽糖結合蛋白（MBP）以及硫氧還蛋白（Trx）均已經(jīng)被證實(shí)能非常成功地生產(chǎn)正確折疊、有生物活性的蛋白質(zhì)，能明顯提高在E.coli細胞質(zhì)中產(chǎn)生的融合蛋白的可溶性，并能抑制包涵體的形成[159，194]。其中每一種都備有方便的純化方法，可將融合蛋白與細胞污染物分開(kāi)。已經(jīng)建立了多種對融合蛋白進(jìn)行位點(diǎn)特異性裂解的方法，方法的選擇通常由特定蛋白的組成、序列及物理性質(zhì)決定[199]�？刹捎弥T如溴化氰（Met↓）、羥胺（Asn↓Gly）、等試劑或低pH(Asp↓Pro)來(lái)進(jìn)行融合蛋白的化學(xué)裂解�；瘜W(xué)裂解的方法較便宜而且有效，甚至常�？梢栽谧冃缘臈l件下裂解非變性不能溶解的蛋白質(zhì)。但有時(shí)目的蛋白中存在裂解位點(diǎn)，或因發(fā)生副反應而導致對蛋白質(zhì)進(jìn)行不必要的修飾，從而阻礙了它們的應用。作為一個(gè)備選方案，酶解的方法相對來(lái)說(shuō)其反映條件較溫和，更重要的是，普遍用于此用途的蛋白酶都具有高度的特異性。其中常用的酶有：Xa因子、凝血酶、腸激酶、凝乳酶和膠原酶。所有這些酶都具有較長(cháng)的底物識別序列，從而降低了蛋白質(zhì)中其他無(wú)關(guān)部位發(fā)生斷裂的可能性。在上述提及的各種酶中，Xa因子和腸激酶應用最多，因為它們切割各自的識別序列的羧基端，使帶有天然氨基酸的被融合部分得以釋放。
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