在大腸桿菌中高效表達外源蛋白的策略（三）

1. mRNA翻譯起始

有關(guān)轉錄過(guò)程的大量知識使得能夠在不被附近核苷酸序列影響的情況下，在表達盒中使用原核啟動(dòng)子^[87]。對于決定蛋白質(zhì)合成的起始因素，雖然尚不能完全弄清楚，但目前已經(jīng)明白，mRNA轉錄本5’末端的獨特結構是mRNA翻譯起始效率的最主要決定因素。至今還沒(méi)有發(fā)現通用的有效起始翻譯的共同序列。已知序列的絕大部分（91%）E.coli基因的翻譯起始區均含有起始密碼子AUG，GUG的利用率為8%，而UUG的利用率則為1%^[88,89]。Shine-Dalgarno(SD)位點(diǎn)在翻譯起始階段與16S rRNA的3'端相互作用。SD與起始密碼子間的距離約為5-13bp，這一距離影響翻譯起始的效率^[90]。人們對此進(jìn)行了深入的研究，以確定最佳的SD區序列和SD與起始密碼子之間的最有效間隔^[91,92]。Ringquist等^[93]研究了RBS的翻譯功能，得出了以下結論：（1）在間隔相同的情況下，UAAGGAGG的SD序列比AAGGA的SD序列能使蛋白質(zhì)的產(chǎn)量提高3­­-6倍；（2）對于同一SD序列，存在一最佳的間隔。AAGGA的間隔為5-7個(gè)核苷酸，而UAAGGAGG的間隔為4-8個(gè)核苷酸；（3）對于同一SD序列，有一翻譯所必需的最小間隔。AAGGA的最小間隔為5個(gè)核苷酸，而UAAGGAGG的最小間隔為3-4個(gè)核苷酸。這些間隔提示，在16S rRNA的3’末端和結合于核糖體P位點(diǎn)的fMet-tRNA_f的反義密碼子之間存在精確的物理關(guān)系。

在mRNA的翻譯起始區的二級結構在決定基因表達效率方面具有重要作用^[94,95,96]。如用一發(fā)卡結構封閉SD區和/或AUG密碼子就會(huì )阻止其與30S核糖體亞單位的結合，從而抑制翻譯^[97]。已經(jīng)設計了幾種不同的策略以使mRNA形成二級結構的可能性最小。提高RBS中A、T殘基的豐度能增強某些基因的表達^[98]。同樣地，突變SD區上游或下游的某些特定核苷酸就會(huì )抑制mRNA二級結構的形成和提高翻譯效率^[99]。另一途徑得益于在E.coli中自然發(fā)生的一種翻譯偶聯(lián)現象^[100]。翻譯偶聯(lián)的機制已被用來(lái)解釋來(lái)自多順?lè )醋觤RNA的不同基因的并列表達。已經(jīng)證明，當galK與上游基因偶聯(lián)翻譯時(shí)，經(jīng)修飾的gal強啟動(dòng)子能夠指導半乳糖激酶的高水平合成。這提示即使很弱的RBS，如果與核糖體結合也能非常有效。這種調節機制有可能在蛋白質(zhì)超量生產(chǎn)生物技術(shù)中發(fā)揮重要作用。事實(shí)上，翻譯偶聯(lián)已經(jīng)被廣泛用于不同基因的高效表達。

除了SD區與16S rRNA結合之外，mRNA和核糖體的其他相互作用也參與翻譯的起始。如核糖體S1蛋白直接參與30S亞基對mRNA的識別和結合^[101]。

2．翻譯增強子

     已經(jīng)在細菌和噬菌體中鑒定了一些在E.coli中顯著(zhù)增強異源基因表達的序列。Olins等從T7噬菌體基因10前導序列（ g10-L）中鑒定了一9bp的序列，該序列似乎能替代有效的RBS。同SD共有序列相比，g10-L能使多種基因的表達水平提高40-340倍^[102]。若將其置于合成SD序列的上游，按照β-半乳糖苷酶的活性與LacZ mRNA的水平來(lái)估計，g10-L序列能使 LacZ的翻譯水平提高110倍^[103]。另外的研究小組在mRNA的5’非翻譯區（UTR）鑒定了一U富含序列，該序列同樣具有翻譯增強子活性。McCarthy等^[104]在 E.coli atpE基因中緊接于SD位點(diǎn)下游鑒定一類(lèi)似區域。有文獻用一30bp的序列超量產(chǎn)生IL-2和IFN-β^[105]。另有人證明在編碼RNase D的rnd mRNA SD位點(diǎn)的上游，有一U₈序列對該mRNA的有效翻譯是必需的。缺失這一區域會(huì )顯著(zhù)降低翻譯，但不影響rnd mRNA的水平和轉錄起始位點(diǎn)^[106]。研究證明這些類(lèi)似序列的靶位是30S核糖體亞單位的S1蛋白^[107]。在另一項有趣的研究中，研究者證明在緊接起始密碼子下游的序列在翻譯起始過(guò)程中發(fā)揮重要作用。位于T7基因0.3編碼區+15至+26之間或位于T7基因10編碼區+9至+21之間被稱(chēng)做下游框（DB）的特定區域具有翻譯增強子的功能。DB區與16S rRNA的1469-1483核苷酸互補，這一區域稱(chēng)做反下游框（ADB）。缺失DB將廢除翻譯活性。相反，如果優(yōu)化DB和ADB之間的互補則會(huì )以最高水平表達dhfr融合基因。有趣的是，如果將DB從起始密碼子的上游移到SD序列的位置，DB則失去功能。DB序列存在于一些E.coli和噬菌體基因中^[108,109]。

上述這些發(fā)現充分證明，除了SD位點(diǎn)和起始密碼子以外，mRNA中的其他序列對于有效的翻譯也是重要的。盡管其精確的機制還不太清楚，但有可能利用翻譯增強子來(lái)達到超量表達蛋白質(zhì)的目的。

3．mRNA的穩定性

     mRNA的快速降解勢必影響蛋白質(zhì)的產(chǎn)生。因此在這一部分重點(diǎn)闡述決定mRNA穩定性的因素，這將在E.coli高效表達外源基因中有實(shí)際應用。在E.coli中有多種不同的RNase參與mRNA的降解，其中包括內切核酸酶（RNase E, RNase K和RNase III）和3’外切核酸酶（RNase II和多聚核苷酸磷酸化酶[PNPase]），目前尚未在原核細胞中發(fā)現5’外切核酸酶^[110]。mRNA的降解并非由非特異性的外切核酸酶隨機剪切而引起，因為在mRNA的長(cháng)度和半衰期之間并沒(méi)有反向相關(guān)性^[111]。已經(jīng)證明，在E.coli中有兩類(lèi)保護性元件能夠穩定mRNA。一類(lèi)由mRNA的5’UTRs中的序列組成^[112]；另一類(lèi)由3’UTRs和多順?lè )醋娱g區的發(fā)卡結構組成^[113]。其中一些元件與異源mRNA融合后起穩定劑作用，但只在嚴格的條件下如此。例如，噬菌體T4基因32的5’UTR在T4噬菌體感染的細胞中延長(cháng)非穩定mRNA在E.coli中的半衰期^[114]。革蘭氏陽(yáng)性菌如金黃色葡萄球菌和枯草桿菌的紅霉素抗性基因（erm）編碼的mRNA 5’UTR含有穩定元件。但ermC和ermA 5'UTRs的穩定作用需要由抑制翻譯和引起核糖體失控的抗生素來(lái)誘導^[115]。同樣，噬菌體λP_L對于λP_L-trp轉錄本的穩定作用需要λ噬菌體的感染^[116]。與此相反，E.coli ompA轉錄本能夠在細胞快速增殖的正常情況下延長(cháng)一系列異源mRNA在E.coli中的穩定性^[117]。Emory等證明，在接近或緊接ompA 5'UTR的5’末端存在發(fā)卡結構對于其穩定效果是必需的。而且可以通過(guò)在5'末端添加發(fā)卡結構來(lái)延長(cháng)在正常情況下不穩定的mRNA的半衰期^[118]。這樣看來(lái)，對異源基因添加ompA 5'穩定元有可能提高E.coli中的基因表達。另一類(lèi)由3’UTR組成的mRNA保護性元件能夠形成發(fā)卡結構，因而能夠阻斷外切核酸酶從3’末端對轉錄本的降解^[113]。Wong和Chang^[119]在蘇云金桿菌的晶體蛋白基因的轉錄終止子中鑒定了一個(gè)這樣的元件。將該“陽(yáng)性反調節子”與地衣桿菌的青霉素酶基因(penP)的3’末端和人IL-2 cDNA融合，能夠延長(cháng)mRNA的半衰期，且提高了相應多肽在枯草桿菌和E.coli中的產(chǎn)量。然而，同某些5’穩定元一樣，這類(lèi)3’反向調節子不可能作為一個(gè)通用的mRNA穩定元。而且有證據表明，可以通過(guò)選用缺乏某些特定RNase如RNaseII或PNPase的宿主菌來(lái)提高基因的表達。這同樣并非一有效途徑。因為缺乏RNaseII或PNPase與RNase過(guò)量表達一樣，對于E.coli整體mRNA的平均半衰期并無(wú)多大影響。而且缺乏RNaseII或PNPase的菌株常常是不穩定的^[120,121]。

4．翻譯終止

 在mRNA中存在終止信號是翻譯終止過(guò)程必不可少的。除了三個(gè)終止密碼子UAA、UGA、

和UAG外，翻譯終止這一復雜事件還包括核糖體、mRNA和終止位點(diǎn)的幾種釋放因子的特異相互作用^[122]。在E.coli中，RF-1在終止密碼子UGA處終止翻譯；RF-2在UAA密碼子處終止翻譯^[123]。最近還克隆了另外一個(gè)因子RF-3^[124]。

在設計表達載體時(shí)，通常插入三個(gè)終止密碼子以防止核糖體的跳躍。在E.coli中偏向于使用UAA密碼子^[125]。一項對于2000多個(gè)E.coli基因的統計分析表明，在終止密碼子和緊接三聯(lián)體的核苷酸序列中存在局部非隨機性^[126]。同時(shí)他們還利用體內終止試驗測定12個(gè)可能的四核苷酸“終止信號”（UAAN、UGAN、UAGN）的終止力量。在體內終止試驗中，通過(guò)其與框架移位的競爭測定其終止效率。轉錄效率依據終止密碼子和第四個(gè)核苷酸而有顯著(zhù)的差異，這種差異從80%（UAAU）到7%（UGAC）不等。這些研究表明，緊接終止密碼子后的核苷酸特性強烈地影響E.coli中的翻譯終止效率^[127]。UAAU是E.coli中最有效的轉錄終止序列。此外，終止密碼子5’末端的鄰近序列也影響終止的效率。因此，新生肽中倒數第二位（-2位）C-末端氨基酸殘基的電荷和疏水性能引起多達30倍不同的UGA終止效率，而在UAG位的終止對于-2位氨基酸殘基的特性不敏感^[128]。對于-1位，α-螺旋、β-鏈和回轉傾向是UGA終止中的決定因素^[129]。