在大腸桿菌中高效表達外源蛋白的策略（二）

l    轉錄水平調控

1.  啟動(dòng)子

能在E.coli中發(fā)揮作用的啟動(dòng)子很多。這些啟動(dòng)子必須具有適合高水平蛋白質(zhì)合成的某些特性。首先啟動(dòng)子的作用要強，待表達基因的產(chǎn)物要占或超過(guò)菌體總蛋白的的10-30%；第二，它必須表現最低水平的基礎轉錄活性。若要求大量的基因表達，最好選用高密度培養細胞和表現最低活性的可誘導和非抑制啟動(dòng)子。如果所表達的蛋白具有毒性或限制宿主細胞的生長(cháng)，選用可抑制的啟動(dòng)子則至關(guān)重要^{[27，28]}。例如，輪狀病毒的VP7蛋白能有效地殺死細胞，因此必須在嚴格控制的條件下表達^[29]。但在某些情況下，啟動(dòng)子的嚴格性并不合理，因為即使最小量的基因產(chǎn)物也能由于其毒性而殺死細胞。如能滅活核糖體或破壞膜滲透壓的分子對細胞來(lái)說(shuō)是致死性的^[30]。對宿主的毒性并不僅限于外源基因，某種自身蛋白的過(guò)量表達也能造成同樣的結果。如編碼外膜磷脂蛋白的traT基因^[31]。另外，不完全抑制的表達系統會(huì )造成質(zhì)粒的不穩定，細胞生長(cháng)速度的下降和重組蛋白產(chǎn)量的降低^[32，33]。Lanzer和Bujard曾對常用的lac啟動(dòng)子-操縱子系統進(jìn)行了廣泛的研究，證明操縱子放在啟動(dòng)子序列的不同位置會(huì )造成70倍差異的抑制。將17bp的操縱子置于-10和-35六聚體區之間所形成的抑制比將其放在-35區的上游或-10區的下游要高50-70倍^[34]。啟動(dòng)子的第三個(gè)特性是其簡(jiǎn)便和廉價(jià)的可誘導性。大量生產(chǎn)蛋白質(zhì)最常用的啟動(dòng)子是熱誘導（λP_L）和化學(xué)誘導(trp)啟動(dòng)子。異丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）誘導的雜交啟動(dòng)子tac^[35]或trc^[36]都是強啟動(dòng)子，在基礎研究中應用很廣。但在大量生產(chǎn)人用治療性蛋白時(shí)用IPTG做誘導劑是不可取的，因為IPTG具有毒性而且價(jià)格昂貴^[37]。IPTG的這些不足至今仍限制tac或trc強啟動(dòng)子在大量生產(chǎn)人用治療性蛋白中的應用。編碼熱敏lac阻遏蛋白^[38]的突變lacI（Ts）基因的出現使得目前能夠對這些啟動(dòng)子進(jìn)行熱誘導^[39，40]。另外，還出現了一些新型載體，它們允許在30℃對trc啟動(dòng)子進(jìn)行嚴緊調節。最近還報道了兩種不同的lac阻遏蛋白突變體，能夠同時(shí)允許熱誘導和IPTG誘導^{[41，42]}。盡管野生型lacI基因也能熱誘導，但不能對其進(jìn)行嚴緊型調節，且不能用于lacI^q 菌株，因為溫度的變化不能遏制由lac阻遏蛋白的過(guò)量表達所造成的嚴緊性抑制^[43]。因此，該系統只能用用于生產(chǎn)對宿主菌無(wú)害的一些蛋白。

冷反應啟動(dòng)子盡管不象其他啟動(dòng)子那樣得到廣泛的研究，但已經(jīng)被證明能在低溫條件下進(jìn)行有效的基因表達。噬菌體λP_L啟動(dòng)子的活性在20℃時(shí)最高，隨著(zhù)溫度的升高，其活性逐漸降低^[44]。P_L啟動(dòng)子的冷反應由E.coli整合宿主因子，一種與DNA結合的序列特異性多功能蛋白來(lái)正調控^[45，46]。主要冷應激基因cspA啟動(dòng)子同樣也被證明在低溫具有活性^[47]。對cspA和P_L啟動(dòng)子進(jìn)行分子剖析，鑒定了在較低溫度下參與增強轉錄的特異性DNA區域。從而開(kāi)發(fā)了一系列在20℃低溫具有高活性的P_L衍生啟動(dòng)子^[48]。選用冷反應啟動(dòng)子的基本原理是在15-20℃的條件下，蛋白質(zhì)的折疊速度只受到輕微的影響，而作為生物化學(xué)反應，轉錄和翻譯的速度將被充分降低。這就為蛋白質(zhì)折疊、產(chǎn)生有活性的蛋白和避免非活性蛋白聚合體即包涵體的形成提供了充足的時(shí)間，而目的蛋白的最終產(chǎn)量并未減少。最近新報道的一些啟動(dòng)子具有諸多誘人之處,為選擇新的高效表達系統提供了方便。如非常強的pH啟動(dòng)子^[49，50],重組蛋白的產(chǎn)量可達總蛋白的40-50%^[51]。但表達的水平會(huì )因不同的基因而有差異。因為蛋白質(zhì)的合成不僅依賴(lài)于啟動(dòng)子的強弱，而且有賴(lài)于轉錄的效率。

人們通常只考慮E.coli啟動(dòng)子的核心區域，即-10和-35六核苷酸區和一15-19bp的間隔序列。但有人提出核心序列以外的元件也能刺激啟動(dòng)子的活性^[52]。許多研究也已證明，核心啟動(dòng)子上游的序列能夠在體內提高轉錄起始的效率^{[53，54，55]}。Gourse等證明，位于E.coli rRNA啟動(dòng)子rrnB P1 -35區上游的DNA序列即UP元件，能夠在體內和體外提高轉錄效率30倍^[56]。UP元件是作為一個(gè)獨立的啟動(dòng)子組件發(fā)揮作用的，因為將其融合到其他啟動(dòng)子如lacUV5中也能刺激轉錄^[57,58]。UP元件與其他啟動(dòng)子融合所表現的這種轉錄增強子效應，使其有望通用于高效表達系統。盡管已經(jīng)證明rRNA啟動(dòng)子P1、P2的超強能力^[59]，但它們仍未被用于E.coli進(jìn)行高水平表達，其主要原因是難以對其進(jìn)行調控。rRNA的體內合成從屬于細胞增殖速度的控制。在細胞快速增殖期，P1和P2是活化的，當細胞處于生長(cháng)的靜息期，則P1、P2被負調節。因此，rRNA啟動(dòng)子在前誘導期將持續活化。在體內快速增殖的細胞中，P2的活性很弱，而且可誘導性差，但若與P1分開(kāi)，P2啟動(dòng)子的活性明顯升高（達到P1的70%），且對應激反應敏感。這表明在天然的串聯(lián)體中，P2是部分關(guān)閉的^[60]。Brosius和Holy^[61]將lac操縱子序列插入到rrnB rRNA P2啟動(dòng)子的下游，在帶有lacIq基因的菌株中成功地抑制了P2的活性。轉錄活性是以氯霉素乙酰轉移酶的產(chǎn)生和4.5s RNA的表達為標準的。然而，P2構建體的活性只相當于tac啟動(dòng)子活性的1/2，而且當rrnB P1啟動(dòng)子被置于P2啟動(dòng)子下游時(shí)，不能完全抑制轉錄。有人試圖利用反轉啟動(dòng)子的方向來(lái)嚴格調控rRNA啟動(dòng)子。將rRNA啟動(dòng)子克隆于目的基因的上游，但轉錄方向相反。利用λ整合位點(diǎn)和可調控的λ整合酶來(lái)實(shí)現啟動(dòng)子的反轉，從而達到進(jìn)行誘導的目的，而且，在高度活化的啟動(dòng)子上游有一強轉錄終止子將避免在前誘導期可能出現的載體的不穩定性。

2. 轉錄終止子

    在原核生物中，轉錄終止有兩種不同的機制。一種是依賴(lài)六聚體蛋白rho的rho依賴(lài)性轉錄終止，rho蛋白能使新生RNA轉錄本從模板解離。另一種是rho非依賴(lài)性轉錄終止，它特異性依賴(lài)于模板上編碼的信號，即在新生RNA中形成發(fā)卡結構的一回文序列區，和位于該回文序列下游4-9bp處的dA、dT富含區^[62,63]。雖然轉錄終止子在表達質(zhì)粒的構建過(guò)程中常被忽略，但有效的轉錄終止子是表達載體必不可少的元件，因為它們具有極其重要的作用。貫穿啟動(dòng)子的轉錄將抑制啟動(dòng)子的功能，造成所謂的啟動(dòng)子封堵^[64]。這種效應可以通過(guò)在編碼序列下游的適當位置放置一轉錄終止子，阻止轉錄貫穿別的啟動(dòng)子來(lái)避免。同樣地，在啟動(dòng)目的基因的啟動(dòng)子上游放置一轉錄終止子，將最大限度地減小背景轉錄^[65]。另有資料證明，由強啟動(dòng)子啟動(dòng)的轉錄會(huì )使轉錄通讀到復制區，造成控制質(zhì)�？截悢档腞OP蛋白的過(guò)量表達，從而導致質(zhì)粒的不穩定^[66]。另外，轉錄終止增強mRNA的穩定性^[67]，從而提高蛋白質(zhì)的表達水平。如果來(lái)源于E.coli rrB rRNA操縱子的兩個(gè)轉錄終止子T1和T2串聯(lián)，則效果更好^[68]。但其他的許多轉錄終止子通常情況下都是十分有效的。

3．轉錄抗終止子

細菌中許多參與氨基酸生物合成的操縱子在其第一個(gè)結構基因的5'端含有轉錄衰減子。衰減子由特定操縱子的氨基酸產(chǎn)物調節。這樣關(guān)聯(lián)的帶電荷tRNA的存在就會(huì )在核糖體剪切之后引導初始轉錄本中二級結構的形成。如果沒(méi)有關(guān)聯(lián)的帶電荷tRNA，則會(huì )形成抗終止子結構，從而抑制終止子中發(fā)卡結構的形成和轉錄的終止^[69]�？菇K止元件能使RNA 多聚酶越過(guò)核糖體RNA操縱子中的rho依賴(lài)性終止子即boxA^[70,71]。轉錄抗終止是有一個(gè)極其復雜的過(guò)程，其中包含許多已知和未知因子。有關(guān)這方面的知識已有詳盡的綜述。在此我們主要討論抗終止元件在E.coli中表達外源基因的應用。

在E.coli表達系統中作用比較強、應用較廣的一個(gè)啟動(dòng)子是噬菌體T7晚期啟動(dòng)子^[72,73]。該系統的活性依賴(lài)于提供T7 RNA多聚酶的轉錄單元。RNA多聚酶的嚴格阻遏對防止T7啟動(dòng)子的滲漏是必需的。有許多用于調節T7多聚酶表達的途徑，但每一種方法都有其各自的缺陷。Merten等通過(guò)構建一基于λP_L調節的反轉衰減T7 RNA多聚酶表達盒闡明了這一問(wèn)題�？梢酝ㄟ^(guò)在啟動(dòng)子和編碼T7多聚酶的基因之間插入三個(gè)串聯(lián)排列的轉錄終止子來(lái)削弱T7多聚酶的基礎表達水平。在誘導的情況下，噬菌體λ來(lái)源的nut_L依賴(lài)的抗終止功能也可以協(xié)同來(lái)阻止轉錄終止^[74]。來(lái)源于E.colirrnB rRNA操縱子的轉錄抗終止區已被用于某些表達載體如pSE420。該載體應用trc啟動(dòng)子^[75]。其基本原理是使得轉錄通過(guò)重度二級結構區，從而減少宿主RNA 多聚酶引起的轉錄提前終止的可能性。但是rrnB抗終止子在這種情況下似乎并不十分有效。

4．嚴緊型調節表達系統

可嚴緊調節的啟動(dòng)子的優(yōu)點(diǎn)使得我們能夠設計許多巧妙、可高度抑制的表達系統。這在表達那些產(chǎn)物對宿主的生長(cháng)不利的基因時(shí)尤其有用。所用的策略包括“鋪平板”法^[76]；提高抑制基因和操縱基因的比例^[77]；用突變的噬菌體感染誘導^{[28 ]}；致弱高拷貝數載體上的啟動(dòng)子活性^[78]；利用轉錄終止子和抗終止子^[79]；在拷貝數可控的質(zhì)粒中使用可誘導的啟動(dòng)子^[80]；使用“交叉調節”系統^[81]；共轉導使用SP6 RNA多聚酶的質(zhì)粒^[82]；利用與克隆基因mRNA互補的反義RNA^[31]。最后一個(gè)巧妙的方法是反轉啟動(dòng)子：在啟動(dòng)子兩側為兩個(gè)λ整合位點(diǎn)，啟動(dòng)子的方向與基因的表達方向相反，而且只通過(guò)由λ整合酶介導的誘導位點(diǎn)特意性遺傳重組來(lái)完成反轉^[83,84]。

上述這些系統也各有其優(yōu)缺點(diǎn)。即依賴(lài)固體培養基的方法不適用于大批量表達，高水平抑制系統常造成蛋白質(zhì)產(chǎn)量的下降^[85]，這就有必要優(yōu)化抑制基因和操縱基因的比例^[86]。由λ噬菌體介導的誘導更增加了系統的復雜性，利用反轉啟動(dòng)子迂回方法又引入了復雜的載體結構。盡管這些表達系統大多數尚未用于蛋白質(zhì)的大規模、高產(chǎn)量生產(chǎn)，但是它們?yōu)榛�因表達提供了重要的工具。