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一旦重組病毒已被純化和鑒定，即可在293 細胞中進(jìn)行大量擴增。本手冊提供了遞增培養規模和腺病毒感染周期的基本方法，按這一方法最終得到的病毒量約為3×1011～3×1012。由于一個(gè)細胞中所含的病毒顆粒為1000～10000，因此1L 培養細胞可得到約5×1012 病毒顆粒。如果要把病毒用氯化銫梯度離心純化，則必須至少3×108 的細胞，這樣才能正確分辨出病毒帶。對于蛋白表達，則根據需要可在任何一步擴增步驟中停止，離心沉淀細胞后按照適當的操作方法進(jìn)行蛋白抽提（根據蛋白類(lèi)型的不同抽提上清或細胞沉淀）。為優(yōu)化時(shí)間進(jìn)程，每個(gè)感染周期必須與下一次細胞擴增培養同步。如果由于各種原因不能同步，則必須將病毒凍存，直至下一次細胞培養開(kāi)始后再融化病毒。注意每次擴增都將會(huì )剩下一些病毒，這些病毒先不必丟棄，以便下一步擴增失敗時(shí)備用。每次擴增最好都用最低代的病毒顆粒，這樣產(chǎn)生突變型病毒的可能性會(huì )大大降低。
操作步驟：
1 在100mm 培養皿或75cm2 培養瓶中加入10ml DMEM5%培養5×106 293 細胞。
2 取0.5ul 首次擴增的病毒保存液，加入DMEM5%至1ml，混勻，這樣稀釋得到的MOI 值約為5。
3 移去培養液，小心加入病毒混合液，切勿破壞細胞單層，十字形慢慢晃動(dòng)3 次，37℃ CO2 孵箱中培養90 分鐘。
4 加入9ml DMEM5%。
5 再培養72 小時(shí)，這時(shí)在10ml 溶液中大約有5×109～5×1010 個(gè)病毒顆粒，進(jìn)行MOI 測定以估計病毒顆粒。
注：如果此時(shí)得到的病毒量已足夠，可立即進(jìn)行病毒滴度測定。收集細胞，600×g 離心5 分鐘沉淀細胞，去上清后加入最小體積（一般為原始體積的1/10 即1ml）病毒保存溶液重懸細胞。-200C /370C 凍融3 次，臺式離心機上以最大速率離心去除細胞碎片，收集上清，然后進(jìn)行病毒滴定。
1 -20℃/37℃凍融3 次。
2轉入15ml 無(wú)菌離心管中，臺式離心機上以最大速率離心10 分鐘，收集上清凍存于-20 ℃或-80 ℃。
3 3 個(gè)175cm2 培養瓶中各加入107 293 細胞進(jìn)行培養。
4 將3ml 細胞裂解液上清加入12ml DMEM5%中，混勻。移去細胞培養液，每瓶小心加入5ml 混合液，十字形慢慢晃動(dòng)混勻3 次，370C 5%CO2 孵箱中培養90 分鐘。此時(shí)MOI 值約為25。
5 加入DMEM5%至30ml。
6 再培養48～72 小時(shí)。此時(shí)10ml 培養液病毒量約為3×1010～3×1011。若需要，進(jìn)行MOI 測定以估計病毒滴度。
注：如果此時(shí)病毒量已可以滿(mǎn)足實(shí)驗所需，則可立即進(jìn)入病毒滴定步驟。600×g 離心5 分鐘收集細胞，棄上清，加入1/10 原始體積的溶液重懸細胞。-200C /370C 凍融3 次，臺式離心機上以最大速率沉淀細胞碎片，收集上清，進(jìn)行病毒滴定。
12. 移入50ml 離心管中，臺式離心機上最大速率離心10 分鐘，取出上清保存。
13. 30 瓶175 cm2 培養瓶中每瓶各加入107 293 細胞。
14. 將45ml 細胞裂解液上清加入105ml DMEM5%混勻，從培養瓶中移去培養液，加入5ml 混合液感染細胞，十字形緩慢晃動(dòng)3 次混勻，370C 培養90 分鐘。此時(shí)MOI 值約為25。
15. 加入DMEM5%至30ml/瓶。
16. 再培養48-72 小時(shí)，此時(shí)約有3×1011～3×1012 個(gè)病毒。若需要，進(jìn)行MOI 測定估計病毒滴度。
如果要收集病毒顆粒，先收集被感染細胞，然后重懸在5ml DMEM5%中。-200C /370C 凍融3 次，離心沉淀細胞碎片。此時(shí)5ml DMEM5%中3×1011～3×1012 個(gè)病毒顆粒，濃度為6×1010～6×1011vp/ml。然后測定病毒滴度，或者用標準的氯化銫密度梯度離心法純化病毒。
在109 細胞中擴增病毒可獲得大量病毒保存液，而在1010 細胞中擴增則有一定技術(shù)性。切勿將擴增后的病毒保存液再用來(lái)感染細胞，因這會(huì )大大增加RCA 產(chǎn)生量。有時(shí)不得不使用純化空斑以最大可能降低RCA 產(chǎn)量。如果已沒(méi)有純化的空斑，那么就不得不重新空斑純化重組病毒，鑒定克隆后再進(jìn)行擴增。如果需要大于擴增4 輪后的病毒量，注意請用早期的病毒作為擴增源。比如，用第2 代病毒產(chǎn)生第3 代病毒。如果沒(méi)有第2 代病毒，那么必須用第1 代病毒來(lái)產(chǎn)生新的第2 代病毒。按這個(gè)原則進(jìn)行擴增可使RCA 水平盡可能低。
如果用于表達蛋白，則可以收集細胞后根據蛋白特點(diǎn)選擇適當方法抽提蛋白。細胞沉淀中一般可提取1-5mg 蛋白，建議在小規模擴增后先測定感染后抽提蛋白的最佳時(shí)間，然后再大量擴增蛋白。
腺病毒擴增
|
第一代 |
第二代 |
第三代 |
第四代 | |
|
每瓶細胞數 |
1×105 |
5×106 |
1×107 |
1×107 |
|
培養瓶大�。╟m2） |
|
75 |
175 |
175 |
|
培養瓶數 |
24 孔板1 孔 |
1 |
3 |
30 |
|
|
|
首次擴增后的病 |
|
|
|
感染來(lái)源 |
稀釋的空斑 |
|
第二代病毒 |
第三代病毒 |
|
|
|
毒保存液 |
|
|
|
|
|
0.5 mL 或 |
|
|
|
每瓶接種量 |
0.1 mL |
|
1 mL |
1.5 mL |
|
|
|
2.5×107 |
|
|
|
總培養體積 |
1 mL |
10 mL |
90 mL |
900 mL |
|
MOI |
0.01 |
5 |
25 |
25 |
|
滴度（VP/mL） |
1×108～9 |
5×108～9 |
3.3×108～9 |
3.3×108～9 |
|
總病毒量 |
1×108～9 |
5×109～10 |
3×1010～11 |
3×1011～12 |
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