微生物代謝組學(xué)及其應用的研究進(jìn)展（1）

[摘　要]　代謝組學(xué)是繼基因組學(xué)、轉錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)之后系統生物學(xué)中形成的另一重要組成部分,也是目前組學(xué)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)之一。代謝組學(xué)技術(shù)對理解細胞功能來(lái)講是一種十分重要的功能基因組學(xué)技術(shù),因為代謝組直接反應了細胞的生理狀態(tài),利用代謝組學(xué)技術(shù)很有可能去發(fā)現細胞新的生化途徑并解釋其正常的或病理的功能。該文就代謝組學(xué)所涉及的技術(shù)及其在微生物領(lǐng)域的應用進(jìn)行綜述。

[關(guān)鍵詞] 代謝組;代謝組學(xué);微生物

    代謝活動(dòng)是生命活動(dòng)的本質(zhì)特征和物質(zhì)基礎。代謝組[1](Metabolome)是指某一組織或細胞在一特定生理時(shí)期內所有低分子量的代謝產(chǎn)物。代謝組學(xué)(Metabolomics)是繼基因組學(xué)、轉錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)之后系統生物學(xué)的另一重要組成部分,也是目前組學(xué)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)之一。細胞內的生命活動(dòng)大多發(fā)生于代謝層面,如細胞信號釋放、能量傳遞、細胞間通信等,代謝產(chǎn)物是基因表達的最終產(chǎn)物,基因和蛋白表達的微小變化可以在代謝物上得到放大,因此代謝組學(xué)技術(shù)對理解細胞功能來(lái)講是一種十分重要的功能基因組學(xué)技術(shù),因為代謝組直接反應了細胞的生理狀態(tài)[2],利用代謝組學(xué)技術(shù)很有可能去發(fā)現細胞新的生化途徑并解釋其正常的或病理的功能[3]。代謝組學(xué)技術(shù)在微生物研究中的技術(shù)路線(xiàn)一般為:生物標本采集→數據獲取→數據分析。本文對該路線(xiàn)中所涉及的方法及其在微生物中的應用進(jìn)行一綜述。

1　生物標本采集

    研究特定條件下培養的細菌的代謝組,首先要對菌體樣品進(jìn)行采集,采集菌體細胞內的代謝產(chǎn)物先要終止其代謝過(guò)程即淬火(quenching),然后提取(extraction)胞內代謝產(chǎn)物。

1.1　淬火

    淬火的方法一般有:①用超濾性膜快速過(guò)濾后立即冰凍細胞[4];②用高氯酸稀釋細胞[5];③在-45℃甲醇溶液中稀釋細胞[6];④培養基置入液氮快速冷凍、解凍、離心收集細胞[7];⑤用帶有預冷的不銹鋼珠的注射器迅速取樣、過(guò)濾收集細胞[7]。在這些方法中,甲醇淬火液易導致嚴重的代謝物滲漏,不適用于精確測定細胞內代謝產(chǎn)物的水平;而快速過(guò)濾則能獲得高水平的代謝產(chǎn)物、氨基酸并阻止三羧酸循環(huán)中間產(chǎn)物的逆轉,能很好地反映細胞內代謝產(chǎn)物的水平[8];Mashego等[7]報道:用液氮快速冷凍的方法定量分析代謝產(chǎn)物亦不可靠,而用帶有預冷的不銹鋼珠的注射器迅速取樣、過(guò)濾收集細胞的方法相對比較適合定量分析代謝產(chǎn)物。

1.2　提取

    代謝組學(xué)的分析需要通過(guò)特定的試劑把某一組織或細胞在一特定生理時(shí)期內所有低分子量的代謝產(chǎn)物提取(extraction)出來(lái)。最佳的提取方法應該包括以下幾點(diǎn)[9]:①最大限度地提取代謝產(chǎn)物;②對有特殊物理或化學(xué)特性的分子無(wú)特異性和吸附性;③不通過(guò)物理或化學(xué)方式破壞或修飾代謝產(chǎn)物。

    目前提取細胞內代謝產(chǎn)物的方法有:①在乙醇緩沖液中煮沸細胞隨后在旋轉蒸發(fā)器中脫水[10];②用高氯酸提取[5];③-45℃甲醇提取[6]。高氯酸提取容易導致大多數代謝產(chǎn)物量的減少或缺失[11],而冷的甲醇可以同時(shí)用來(lái)進(jìn)行淬火和提取胞內代謝產(chǎn)物,且不導致有揮發(fā)性的代謝產(chǎn)物如丙酮酸蒸發(fā)掉,是首選的提取方法[12]。但是Rabinowi tz等[13]最近研究發(fā)現冷的甲醇-水(50∶50)液能使三磷酸核苷酸顯著(zhù)降解,導致三磷酸的丟失從而引起磷酸化的核苷酸衍生物(如磷酸鹽、核苷、堿基)的丟失,影響對代謝組的研究,進(jìn)而錯估細胞內的能荷;實(shí)驗中發(fā)現酸性乙腈液能使三磷酸根的降解達到最小,減少高能代謝物的丟失及其向低能衍生物的轉化,從而提高代謝物的提取量,因此乙腈-甲醇-水-液是提取代謝物的首選。

    適當的取樣是代謝組學(xué)技術(shù)精確和有效的關(guān)鍵,通常的取樣技術(shù)能引起細胞內代謝產(chǎn)物水平出現誤差。抑制代謝物滲漏的影響、減少取樣時(shí)間的影響、數據的有效性檢查均需進(jìn)一步改進(jìn)。不同取樣方法聯(lián)用是覆蓋微生物細胞內代謝物范圍的最佳方法。

2　數據獲取

    在細胞內代謝產(chǎn)物提取后緊接著(zhù)就是如何對這些提取物進(jìn)行分辨、鑒定和定量分析以獲取原始數據。酶分析法雖然特異性高,但是其所需樣品體積多,而且一次只能分析一種物質(zhì)。隨著(zhù)色譜技術(shù)和質(zhì)譜技術(shù)的發(fā)展,從小體積樣品中同時(shí)分析多種代謝產(chǎn)物成為了可能。目前應用比較多的方法有以下幾種[14]。

2.1　氣相色譜-質(zhì)譜在代謝組學(xué)中的應用

    氣相色譜-質(zhì)譜(Gas chromatography coupledto mass spectrometry,GC-MS )在代謝組學(xué)研究中是很受歡迎的工具。大多數GC-MS代謝產(chǎn)物分析用于植物代謝組學(xué)而不是微生物和生物醫學(xué)的研究。但是,隨著(zhù)代謝工程領(lǐng)域的快速發(fā)展和分析技術(shù)的新進(jìn)展使得GC-MS在微生物代謝組學(xué)的應用越來(lái)越多。

    GC-M S分離技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)是高分離效率(其亮點(diǎn)是能分辨同質(zhì)異構體)、易用、耐用和低成本。GC-MS 由于高標準化地應用了電子電離,能產(chǎn)生廣泛的和高重復性的破裂片段,這使得能夠通過(guò)配合代謝產(chǎn)物的相對保留時(shí)間、滯留指數、質(zhì)譜裂解譜、已知的可預言的來(lái)自數據庫的信息去鑒定代謝產(chǎn)物。

    GC-M S最主要的缺點(diǎn)是分析物必須為能揮發(fā)的物質(zhì)。由于大部分代謝產(chǎn)物是不能揮發(fā)的,因此,需進(jìn)行繁復的衍生化步驟是必須的。而且,熱不穩定的化合物如磷酸化代謝產(chǎn)物在GC爐中接觸高溫時(shí)容易降解,加之代謝產(chǎn)物對衍生劑有不同的親和力,使得定量分析不準確,必須使用標準化的衍生化試劑和數據校正手段才能避免這種偏差。另外,衍生化過(guò)程中能出現副產(chǎn)品,而且分析物可能會(huì )發(fā)生轉變(如精氨酸轉為鳥(niǎo)氨酸,開(kāi)鏈糖的成環(huán))和(或)終產(chǎn)物的降解(如三甲基硅烷基衍生物的水解),都會(huì )引起對所產(chǎn)生數據的誤解。兩步衍生化方法(如硅烷化后再甲肟化)能提高待分析產(chǎn)物的范圍。

    由于生物樣品復雜的性質(zhì)而要求有效的分離操作和改良的儀器,從而導致了多維分離儀器的產(chǎn)生,如GC-GC tmie of flight(TOF)-MS(全二維氣相色譜/飛行時(shí)間質(zhì)譜)技術(shù)。這種新方法呈現出很高的峰分辨能力并增加了敏感性,而TOF-MS對改良檢測提供了非�？斓膾呙杪屎皖~外的敏感性。而且,兩個(gè)不同GC柱(如極性或非極性)的使用通過(guò)選擇性的改善為代謝組學(xué)分析提供了更大的產(chǎn)物分析范圍。

2.2　液相色譜-質(zhì)譜在代謝組學(xué)的應用

    液相色譜-質(zhì)譜(Liquid chromatography coup led to mass spectrometry,LC-M S)作為一種獨立的技術(shù),在分析代謝產(chǎn)物時(shí)有顯著(zhù)的優(yōu)點(diǎn),這不僅因為不必衍生化分析物,而且還具有能分辨大量代謝物的能力。LC分離與電噴霧(ESI)聯(lián)用,能使大部分代謝產(chǎn)物被極化和電離以更加利于鑒別。此外,還能通過(guò)離子配對(IP)LC-MS、親水作用液相色譜(H LI IC)MS和反相LC-MS技術(shù)從固定相到流動(dòng)相同時(shí)定量分析不同類(lèi)型的代謝產(chǎn)物。因而LC比GC應用范圍更廣。

    B rauerMJ等[15]用H IL IC-MS測得大腸桿菌和釀酒酵母菌饑餓應急反應的代謝圖譜,在碳或氮源供斷情況下,測到68種代謝產(chǎn)物的濃度發(fā)生了變化。Wu L等[16]用同位素標記釀酒酵母菌提取物作為內參,用LC-ESI-MS-MS測定了釀酒酵母菌在葡萄糖刺激下的糖酵解和三羧酸循環(huán)的中間產(chǎn)物的濃度。LC-MS因其對樣品預處理要求簡(jiǎn)單、檢測物質(zhì)的范圍更廣等優(yōu)勢,因而在代謝組學(xué)領(lǐng)域的應用和發(fā)展也越來(lái)越快。

2.3　毛細管電泳-質(zhì)譜在代謝組學(xué)上的應用

    毛細管電泳-質(zhì)譜(Capillary electrophoresiscoup led to ma ss spectrome try,CE-MS )在分析復雜的代謝化合物上比GC-MS、LC-MS更有潛在的優(yōu)勢,包括高分辨效率,極小的樣品量(nL),方法快捷,較低的試劑消耗。

    Ohashi Y等[17]用CE-MS對大腸桿菌的陰離子、陽(yáng)離子代謝產(chǎn)物進(jìn)行了綜合和定量分析。在初級代謝中375種帶電的親水中間產(chǎn)物被鑒定,其中的198種被定量,進(jìn)一步明確了CE-MS能用于微生物代謝領(lǐng)域。

    CE也有一定的局限性,主要是由于其小樣品量所致的敏感性降低,尤其是與MS聯(lián)用時(shí),樣品能進(jìn)一步被屏極液稀釋。但是通過(guò)減少屏極液流速和使用聯(lián)機對樣品進(jìn)行預濃縮(如PH介導的堆積和短暫的等速電泳)[18]能得到與LC-MS相似的敏感性。而且屏極液稀釋帶來(lái)的影響可通過(guò)使用無(wú)屏極界面[3]來(lái)解決。

    目前還沒(méi)有一種技術(shù)能輕易分辨微生物提取物中上百種的代謝產(chǎn)物。雖然理論上能精確完成,但是最廣泛的代謝產(chǎn)物的覆蓋度需要聯(lián)合多種能互相重疊的分離技術(shù),通過(guò)優(yōu)勢互補以分辨不同物理化學(xué)特性的化合物。

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