質(zhì)粒DNA的分離、純化和鑒定

　　把一個(gè)有用的目的DNA段通過(guò)重組DNA技術(shù),送進(jìn)受體細胞中去進(jìn)行繁殖和表達的工具叫載體(Vector)。細菌質(zhì)粒是重組DNA技術(shù)中常用的載體。

　　質(zhì)粒(Plasmid)是一種染色體外的穩定遺傳因子,大小從1-200kb不等,為雙鏈、閉環(huán)的DNA分子,并以超螺旋狀態(tài)存在于宿主細胞中。質(zhì)粒主要發(fā)現于細菌、放線(xiàn)菌和真菌細胞中，它具有自主復制和轉錄能力,能在子代細胞中保持恒定的拷貝數,并表達所攜帶的遺傳信息。質(zhì)粒的復制和轉錄要依賴(lài)于宿主細胞編碼的某些酶和蛋白質(zhì)，如離開(kāi)宿主細胞則不能存活,而宿主即使沒(méi)有它們也可以正常存活。質(zhì)粒的存在使宿主具有一些額外的特性,如對抗生素的抗性等。F質(zhì)粒(又稱(chēng)F因子或性質(zhì)粒)、R質(zhì)粒(抗藥性因子)和Col質(zhì)粒(產(chǎn)大腸桿菌素因子)等都是常見(jiàn)的天然質(zhì)粒。

　　質(zhì)粒在細胞內的復制一般有兩種類(lèi)型:緊密控制型(Stringent control)和松馳控制型(Relaxed control)。前者只在細胞周期的一定階段進(jìn)行復制,當染色體不復制時(shí),它也不能復制,通常每個(gè)細胞內只含有1個(gè)或幾個(gè)質(zhì)粒分子,如F因子。后者的質(zhì)粒在整個(gè)細胞周期中隨時(shí)可以復制,在每個(gè)細胞中有許多拷貝,一般在20個(gè)以上,如Col E1質(zhì)粒。在使用蛋白質(zhì)合成抑制劑-氯霉素時(shí),細胞內蛋白質(zhì)合成、染色體DNA復制和細胞分裂均受到抑制,緊密型質(zhì)粒復制停止,而松馳型質(zhì)粒繼續復制,質(zhì)�？截悢悼捎稍瓉�(lái)20多個(gè)擴增至1000-3000個(gè),此時(shí)質(zhì)粒DNA占總DNA的含量可由原來(lái)的2%增加至40-50%。

　　   利用同一復制系統的不同質(zhì)粒不能在同一宿主細胞中共同存在,當兩種質(zhì)粒同時(shí)導入同一細胞時(shí),它們在復制及隨后分配到子細胞的過(guò)程中彼此競爭,在一些細胞中,一種質(zhì)粒占優(yōu)勢,而在另一些細胞中另一種質(zhì)粒卻占上風(fēng)。當細胞生長(cháng)幾代后,占少數的質(zhì)粒將會(huì )丟失,因而在細胞后代中只有兩種質(zhì)粒的一種，這種現象稱(chēng)質(zhì)粒的不相容性(Incompatibility)。但利用不同復制系統的質(zhì)粒則可以穩定地共存于同一宿主細胞中。

質(zhì)粒通常含有編碼某些酶的基因,其表型包括對抗生素的抗性,產(chǎn)生某些抗生素,降解復雜有機物,產(chǎn)生大腸桿菌素和腸毒素及某些限制性?xún)惹忻概c修飾酶等。

　　質(zhì)粒載體是在天然質(zhì)粒的基礎上為適應實(shí)驗室操作而進(jìn)行人工構建的。與天然質(zhì)粒相比,質(zhì)粒載體通常帶有一個(gè)或一個(gè)以上的選擇性標記基因(如抗生素抗性基因)和一個(gè)人工合成的含有多個(gè)限制性?xún)惹忻缸R別位點(diǎn)的多克隆位點(diǎn)序列,并去掉了大部分非必需序列,使分子量盡可能減少,以便于基因工程操作。大多質(zhì)粒載體帶有一些多用途的輔助序列,這些用途包括通過(guò)組織化學(xué)方法肉眼鑒定重組克隆、產(chǎn)生用于序列測定的單鏈DNA、體外轉錄外源DNA序列、鑒定片段的插入方向、外源基因的大量表達等。一個(gè)理想的克隆載體大致應有下列一些特性：（1）分子量小、多拷貝、松馳控制型；（2）具有多種常用的限制性?xún)惹忻傅膯吻悬c(diǎn)；（3）能插入較大的外源DN***段；（4）具有容易操作的檢測表型。常用的質(zhì)粒載體大小一般在1kb至10kb之間，如PBR322、PUC系列、PGEM系列和pBluescript（簡(jiǎn)稱(chēng)pBS）等。

　　從細菌中分離質(zhì)粒DNA的方法都包括3個(gè)基本步驟:培養細菌使質(zhì)粒擴增；收集和裂解細胞;分離和純化質(zhì)粒DNA。采用溶菌酶可以破壞菌體細胞壁,十二烷基磺酸鈉(SDS)和Triton X-100可使細胞膜裂解。經(jīng)溶菌酶和SDS或Triton X-100處理后,細菌染色體DNA會(huì )纏繞附著(zhù)在細胞碎片上,同時(shí)由于細菌染色體DNA比質(zhì)粒大得多,易受機械力和核酸酶等的作用而被切斷成不同大小的線(xiàn)性片段。當用強熱或酸、堿處理時(shí)，細菌的線(xiàn)性染色體DNA變性,而共價(jià)閉合環(huán)狀DNA(Covalently closed circular DNA，簡(jiǎn)稱(chēng)cccDNA)的兩條鏈不會(huì )相互分開(kāi)，當外界條件恢復正常時(shí)，線(xiàn)狀染色體DN***段難以復性,而是與變性的蛋白質(zhì)和細胞碎片纏繞在一起,而質(zhì)粒DNA雙鏈又恢復原狀,重新形成天然的超螺旋分子,并以溶解狀態(tài)存在于液相中。

在細菌細胞內,共價(jià)閉環(huán)質(zhì)粒以超螺旋形式存在。在提取質(zhì)粒過(guò)程中，除了超螺旋DNA外，還會(huì )產(chǎn)生其它形式的質(zhì)粒DNA。如果質(zhì)粒DNA兩條鏈中有一條鏈發(fā)生一處或多處斷裂,分子就能旋轉而消除鏈的張力,形成松馳型的環(huán)狀分子,稱(chēng)開(kāi)環(huán)DNA(Open circular DNA, 簡(jiǎn)稱(chēng)ocDNA)；如果質(zhì)粒DNA的兩條鏈在同一處斷裂,則形成線(xiàn)狀DNA(Linear DNA)。當提取的質(zhì)粒DNA電泳時(shí),同一質(zhì)粒DNA其超螺旋形式的泳動(dòng)速度要比開(kāi)環(huán)和線(xiàn)狀分子的泳動(dòng)速度快。

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