食源性致病菌檢測技術(shù)（11）

致瀉性大腸埃希氏菌

    致瀉性大腸埃希氏菌能使人類(lèi)致病，監診表現主要為嚴重腹瀉，多數表現為敗血癥。根據血清型別、毒力和所致臨床癥狀可分為產(chǎn)腸毒素性大腸埃希氏菌（ETEC）、腸致病性大腸埃希氏菌（EPEC）、腸侵襲性大腸埃希氏菌（EIEC）、腸出血性大腸埃希氏菌（EHEC）以及腸粘附性大腸埃希氏菌（EAEC）五類(lèi)。 

1．常規分離鑒定技術(shù)：按照GB/T4789-2003方法進(jìn)行

    酶聯(lián)免疫法（ELISA）：應用O157：H7多克隆抗體包被酶標板，加入適當稀釋與處理的糞便標本后，再與過(guò)氧化物酶標記的抗O157：H7抗體結合，加底物顯色，此法可直接檢測糞便中O157：H7大腸埃希氏菌抗原，結果與細菌培養法一致。 

    免疫磁珠分離法（IMS）：用免疫磁分離法檢測牛糞便和食品標本的大腸桿菌O157：H7�？商岣吡舜竽c桿菌O157：H7感染病例的檢出率，與PCR符合率高。 

2．快速酶觸反應：大腸埃希氏菌具β-葡萄糖醛酸酶，但以O157：H7為代表的腸出血性大腸埃希氏菌（EHEC）卻不具此酶。 

    毒素及毒力因子檢測：包括LT、ST、Hly、SLT、Stx、EaeA、VT、EAST等，過(guò)去多用動(dòng)物或細胞培養測定，現可用其單抗以多種免疫學(xué)手段檢出，也可用基因探針技術(shù)或PCR等分子生物學(xué)技術(shù)檢測。同時(shí)檢測Hly和SLT基因，能快速檢測和鑒定EHEC菌株，并與EPEC區分開(kāi)來(lái)。 

    基因探針和PCR技術(shù)：國內徐建煙根據溶血素hlyAB基因序列設計了鑒定EHEC的特異DNA探針，敏感性特異性達99%。Fortin將套式PCR技術(shù)和熒光探針技術(shù)相結合來(lái)檢測O157，該方法不僅可以鑒定與O157抗血清有交叉反應的菌株，而且靈敏度高，可檢測牛奶和蘋(píng)果汁中102CFU/ml，的細菌，如果先進(jìn)行6h增菌，可檢測1CFU/ml的細菌。

基因芯片：Chizhikov將6個(gè)編碼大腸桿菌細菌抗原和毒力的特異基因探針（EaeA，SltI，SltII，FliC，RfbE，IpaH）點(diǎn)樣在玻片上，取多重PCR擴增產(chǎn)物與之雜交，用于同時(shí)檢測和鑒定食物中毒相關(guān)的腸道病原體，該芯片可同時(shí)檢測15種沙門(mén)菌、志賀菌和大腸桿菌的毒力因子。 

    細胞粘附試驗：傳統的細胞粘附試驗是檢測EIEC的標準方法。方法為在24孔板的孔中圓形玻片上培養的HEP-2細胞單層，生長(cháng)致50%；待檢菌以L肉湯培養，37℃，靜止培養16h；每孔加入20ul菌液（含2×107個(gè)菌），置37℃，5%CO2溫育3h，培養液中含1%α-甲基-D-甘露醇；Hank’s平衡鹽溶液洗培養板3次；70%乙醇固定，10%Giema染色，取出圓形玻片，置載玻片上，油鏡觀(guān)察。 

3．分子流行病學(xué)分型方法

    血清型分型技術(shù)：包括O、K、H、F四種抗原。O抗原共171種，其中162種與腹瀉有關(guān)，是分群的基礎。K抗原103種。從病人新分離的大腸埃希氏菌多有K抗原。根據耐熱性等不同，K抗原分為L、A、B三種，其中L、B不耐熱，有60種。F抗原至少有5種，與大腸埃希氏菌的粘附作用有關(guān)。血清型的表示方式可按O：K：H排列，例如O：K：H如O111：K58（B4）：H2；O：K如O8：K88；O：H如O168：H27。 

    脈沖場(chǎng)電泳（PFGE）分型：用核糖體分型和脈沖腸電泳技術(shù)，對急性分泌型腹瀉病人中分離的ETEC病原菌分析，血清型相同的ETEC菌株具有遺傳異質(zhì)性，不同血清型的ETEC菌株其PFEG型一致。美國國家公共衛生實(shí)驗室已完成了PFGE的標準化流程的制定。 

    隨機引物擴增DNA多態(tài)性（RAPD）和擴增片段長(cháng)度多態(tài)性（FAFLP）分析分型技術(shù)：用隨機擴增多態(tài)性DNA技術(shù)（RAPD）分析，發(fā)現具有相同表型特征的ETEC菌株，用分子生物學(xué)分型方法能揭示菌株間的差異，這些差異往往在不能在對ETEC的表型中顯示出來(lái)。有學(xué)者認為FAFLP比PFGE具有更高的鑒定能力，擴增片段可精確到±1bp。

噬菌體分型：目前，通過(guò)對噬菌體感受性的不同，已獲得80余種噬菌體型。

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