包涵體表達的蛋白的復性（二）

復性：

通過(guò)緩慢去除變性劑使目標蛋白從變性的完全伸展狀態(tài)恢復到正常的折疊結構，同時(shí)去除還原劑使二硫鍵正常形成。一般在尿素濃度4M左右時(shí)復性過(guò)程開(kāi)始，到2M左右時(shí)結束。對于鹽酸胍而言，可以從4M開(kāi)始，到1.5M 時(shí)復性過(guò)程已經(jīng)結束。

復性中常采用的方法有：

稀釋復性：直接加入水或緩沖液，放置過(guò)夜，缺點(diǎn)是體積增加較大，變性劑稀釋速度太快，不易控制。

透析復性：好處是不增加體積，通過(guò)逐漸降低外透液濃度來(lái)控制變性劑去除速度，有人稱(chēng)易形成沉淀，且不適合大規模操作，無(wú)法應用到生產(chǎn)規模。

超濾復性：在生產(chǎn)中較多的使用，規模較大，易于對透析速度進(jìn)行控制，缺點(diǎn)是不適合樣品量較少的情況，且有些蛋白可能在超濾過(guò)程中不可逆的變性。

柱上復性：是最近研究較多并成功的在生產(chǎn)中應用的一種復性方法，如華北制藥的G-CSF復性據說(shuō)是通過(guò)柱上復性進(jìn)行的。常用于復性的層析方法有SEC、HIC等。

還原劑的去除：

還原劑一般和變性劑的去除一起慢慢的氧化去除，使二硫鍵慢慢形成。但是由于二硫鍵的形成并不是蛋白質(zhì)正確折疊所必須的，可以考慮在變性劑完全去除之后，在去除還原劑使已經(jīng)按照正確的結構相互接近的巰基間形成正確的二硫鍵。

常用的氧化方法有：

空氣氧化法：在堿性條件下通空氣，或者加入二價(jià)銅離子，能夠取得更好的效果，缺點(diǎn)是不易控制氧化還原電勢。

氧化還原電對（redox）：常采用GSSG/GSH，通過(guò)調整兩者的比例來(lái)控制較精確的氧化還原電勢，也可以在添加了還原劑如BME、DTT的增溶液中直接加入GSSG,如：5mMGSSG/2mM DTT=GSH/GSSG(1.33/1)。

復性的效率：

復性是一個(gè)非常復雜的過(guò)程，除與蛋白質(zhì)復性的過(guò)程控制相關(guān)外，還很大程度上與蛋白質(zhì)本身的性質(zhì)有關(guān)，有些蛋白非常容易復性，如牛胰RNA酶有12對二硫鍵，在較寬松的條件下復性效率可以達到95%以上，而有一些蛋白至今沒(méi)有發(fā)現能夠對其進(jìn)行復性的方法如IL-11，很多蛋白的復性效率只有百分之零點(diǎn)幾。一般說(shuō)來(lái)，蛋白質(zhì)的復性效率在20%左右。影響復性效率的因素有蛋白質(zhì)的復性濃度，變性劑的起始濃度和去除速度、溫度、pH、氧化還原電勢、離子強度、共溶劑和其他添加劑的存在與否等。

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