包涵體表達的蛋白的復性（一）

包涵體：

包涵體是指細菌表達的蛋白在細胞內凝集，形成無(wú)活性的固體顆粒。

包涵體的組成與特性：

一般含有50%以上的重組蛋白，其余為核糖體元件、RNA聚合酶、外膜蛋白ompC、ompF和ompA等，環(huán)狀或缺口的質(zhì)粒DNA，以及脂體、脂多糖等，大小為0.5-1um，難溶與水，只溶于變性劑如尿素、鹽酸胍等。

包涵體的形成：

主要因為在重組蛋白的表達過(guò)程中缺乏某些蛋白質(zhì)折疊的輔助因子，或環(huán)境不適，無(wú)法形成正確的次級鍵等原因形成的。

1、表達量過(guò)高，研究發(fā)現在低表達時(shí)很少形成包涵體，表達量越高越容易形成包涵體。原因可能是合成速度太快，以至于沒(méi)有足夠的時(shí)間進(jìn)行折疊，二硫鍵不能正確的配對，過(guò)多的蛋白間的非特異性結合，蛋白質(zhì)無(wú)法達到足夠的溶解度等。

2、重組蛋白的氨基酸組成：一般說(shuō)含硫氨基酸越多越易形成包涵體，而脯氨酸的含量明顯與包涵體的形成呈正相關(guān)。

3、重組蛋白所處的環(huán)境：發(fā)酵溫度高或胞內pH接近蛋白的等電點(diǎn)時(shí)容易形成包涵體。

4、重組蛋白是大腸桿菌的異源蛋白，由于缺乏真核生物中翻譯后修飾所需酶類(lèi)，致使中間體大量積累，容易形成包涵體沉淀。因此有人采用共表達分子伴侶的方法以增加可溶蛋白的比例。

包涵體表達的有利因素：

1、可溶性蛋白在細胞內容易受到蛋白酶的攻擊，包涵體表達可以避免蛋白酶對外源蛋白的降解。

2、降低了胞內外源蛋白的濃度，有利于表達量的提高。

3、包涵體中雜蛋白含量較低，且只需要簡(jiǎn)單的低速離心就可以與可溶性蛋白分離，有利于分離純化。

4、對機械攪拌和超聲破碎不敏感，易于破壁，并與細胞膜碎片分離。

破菌：

1、機械破碎

2、超聲破碎

3、化學(xué)方法破碎

分離：

1、離心：5000-20000g15min離心，可使大多數包涵體沉淀，與可溶性蛋白分離。

2、過(guò)濾或萃取方法：

洗滌：

由于脂體及部分破碎的細胞膜及膜蛋白與包涵體粘連在一起，在溶解包涵體之前要先洗滌包涵體，通常用低濃度的變性劑如2M尿素在50mM TrispH7.0-8.5左右,1mMEDTA中洗滌。此外可以用溫和去垢劑TritonX-100洗滌去除膜碎片和膜蛋白。

溶解：

常用的變性劑有尿素（8M）、鹽酸胍（GdnHCl6-8M），通過(guò)離子間的相互作用，破壞包涵體蛋白間的氫鍵而增溶蛋白。其中尿素的增溶效果少差，異氰硫酸胍（GdnSCN）最強。

去垢劑：如強的陰離子去垢劑SDS，可以破壞蛋白內的疏水鍵，可以增溶幾乎所有的蛋白。問(wèn)題是由于SDS無(wú)法徹底的去除而不允許在制藥過(guò)程中使用。

極端pH：可以破壞蛋白的次級鍵從而增溶蛋白。如有人在pH>9.0溶解牛生長(cháng)激素和牛凝乳蛋白酶包涵體。有些蛋白可以溶解在60mMHCl中。這些方法只適合于少部分蛋白的增溶。

變性劑的使用濃度和作用時(shí)間：一般在偏堿性性的環(huán)境中如pH8.0-9.0，尿素在堿性環(huán)境中不穩定，一般不要超過(guò)pH1.0。有些蛋白只能用鹽酸胍如IL-4。增溶時(shí)一般室溫過(guò)夜，但鹽酸胍在37度1小時(shí)便可以使多數蛋白完全變性溶解。

還原劑：

由于蛋白間二硫鍵的存在，在增溶時(shí)一般使用還原劑。還原劑的使用濃度一般是50-100mM2-BME或DTT，也有文獻使用5mM濃度。在較粗放的條件下，可以使用5ml/l的濃度。還原劑的使用濃度與蛋白二硫鍵的數目無(wú)關(guān)，而有些沒(méi)有二硫鍵的蛋白加不加還原劑無(wú)影響，如牛生長(cháng)激素包涵體的增溶。對于目標蛋白沒(méi)有二硫鍵某些包涵體的增溶，有時(shí)還原劑的使用也是必要的，可能由于含二硫鍵的雜蛋白影響了包涵體的溶解。

上一篇：E試驗法測定抗菌藥物最低抑菌濃度（MIC）方法

下一篇：包涵體表達的蛋白的復性（二）