食源性致病菌檢測技術(shù)（1）

單核細胞增生李斯特氏菌

    單核細胞增生李斯特氏菌（簡(jiǎn)稱(chēng)LM）是一種人畜共患病的病原菌。感染后主要 表現為敗血癥、腦膜炎和單核細胞增多。是冷藏食品威脅人類(lèi)健康的主要病原菌之一。 

1．常規分離鑒定技術(shù)

    常規檢查：直接涂片檢查可見(jiàn)革蘭氏陽(yáng)性短桿菌。

    細菌學(xué)檢查：食品、水等相關(guān)食源性標本檢測按照[GB/4789-2003]方法進(jìn)行，其它標本直接分離于TSA-YE或其它李斯特氏菌選擇性瓊脂平板，在有氧環(huán)境下培養，30℃培養24-48h后，選擇典型菌落進(jìn)行生化鑒定及動(dòng)力試驗。 

    小鼠毒力試驗：將分離的菌株接種到10mlTSB-YE肉湯中，35℃培養24h，將培養物離心、濃縮，用1ml生理鹽水制成菌懸液（濃度為1010個(gè)菌/ml），取0.1ml腹腔注射體重為16-18g小鼠,每組5個(gè)觀(guān)察7d內小鼠死亡情況。用已知致病的LM和非致病的英諾克李斯特氏菌相同方法進(jìn)行，做對照試驗。 

    協(xié)同溶血試驗：在羊血瓊脂平板上平板接種β-溶血金黃色葡萄球菌和馬紅球菌，在它們中間垂直劃線(xiàn)接種可疑菌，與兩線(xiàn)相近但不相關(guān)，在30℃培養24h-48h，檢查平板中垂直接種點(diǎn)對溶血環(huán)的影響�？拷�金黃色葡萄球菌接種點(diǎn)的LM的溶血增強，西爾李斯特氏菌的溶血也增強，綿羊李斯特氏菌在馬紅血球附近的溶血增強。 

    毒力基因鑒定：包括Hly、PlcA、PlcB、ActA、PrfA、Inl、Iap和Mpl等。以上基因檢測，均可使用PCR方法進(jìn)行。所用引物，可采用國際、國內、或著(zhù)名刊物公開(kāi)發(fā)表的引物。模板DNA的提取可采用熱裂解法，經(jīng)過(guò)PCR擴增和凝膠電泳對擴增產(chǎn)物的鑒定，判斷被測菌是否攜帶相關(guān)的毒力基因。PCR檢測：用PCR技術(shù)對LM的特異性進(jìn)行研究，經(jīng)引物LA1和LB2、LMIR和LM3F擴增產(chǎn)生區別于其它革蘭氏陽(yáng)性菌及革蘭氏陰性菌的590bp，340bp的片段，為Lm的特異性檢測提供了依據。 

2．分子流行病學(xué)分型方法

    血清型分型：根據菌體（O）抗原和鞭毛（H）抗原，將LM分成16個(gè)血清型，分別是1/2a、1/2b、1/2c、3a、3b、3c、4a、4b、4ab、4c、4d、4e、5、6a、6b和7。致病菌株的血清型一般為1/2a、1/2b、1/2c、3a、3b、3c、4a、4b和5。 

    方法為將待鑒定菌接種到TSA-YE瓊脂斜面菌苔洗下，菌懸液于80℃水浴中加熱1h，以2500r/min離心30，棄去上清液，將剩余液與沉淀混勻制成菌懸液，進(jìn)行血清學(xué)玻片凝集試驗。 

    脈沖場(chǎng)電泳（PFGE）分型：LM的血清型能用PFGE圖譜反映。Ojeniyi等認為，同一個(gè)PFGE亞型的LM的血清型是相同的，但相同血清型的LM菌株PFGE亞型則并不一定相同。PFGE分型較血清分型、酶電泳分型、RT、RAPD分型方法的分型能力均強。但建立PFGE電泳系統的花費昂貴，不利于其在流行病學(xué)調查中的大規模應用。 

    隨機引物擴增DNA多態(tài)性分析（RAPD）分型技術(shù)：RAPD分型法對于某一地區及不同地區間李斯菌暴發(fā)或散發(fā)流行病學(xué)的研究、發(fā)現新的流行株及其來(lái)源都有重要意義。但是由于采用的引物短，T值低，擴增結果易受到外界因素的影響，實(shí)驗的重復性較差。

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