細胞冷凍保存法及解凍培養技巧

培養細胞時(shí)為防止以下問(wèn)題，細胞將做冷凍保存:第一、株化細胞產(chǎn)生性狀轉變(transformation)。第二、污染。第三、株化細胞之增殖或生理特性有特定之限制，只能在一定的代數范圍內進(jìn)行增殖培養或進(jìn)行特定實(shí)驗。目前可能解決這些困難的方法其中之一是細胞冷凍保存法，將冷凍細胞儲于冷凍管中，將其中一部分拿出來(lái)做一些必要的檢查，其它的冷凍細胞則在需要時(shí)拿出來(lái)解凍，用來(lái)進(jìn)行實(shí)驗。本方法亦可節省繼代培養時(shí)所花費的勞力、物力，并可防止培養中經(jīng)常發(fā)生意外事故，喪失細胞珠。因此冷凍保存法為細胞培養研究上之基本技術(shù)之一。

[說(shuō)明] :

1.經(jīng)過(guò)冷凍保存后的細胞，其生存率會(huì )下降，冷凍時(shí)之冷卻速度，保存溫度，解凍時(shí)升高溫度的速度以及添加之冷凍保存液之種類(lèi)、濃度等都可影響細胞存活率。

2. 一般而言，４℃以下慢慢地冷凍，保存于液態(tài)氮中(-196℃)。

3. 37℃快速解凍。

4.保護劑（抗凍劑）：添加甘油 (glycerol) ( I0 %左右 ) 或dimethy1sulfoxide (DMSO) ( 5- 10% ) 。

5.有些細胞如果采用上述的方法時(shí)，無(wú)法得到高的存活率。此時(shí)，則必需考慮可能傷害細胞的機制，添加劑之作用等而來(lái)找出適當的條件來(lái)修正。

[材料] :

1.增殖期之細胞 (9成滿(mǎn))，培養于培養皿中數個(gè)。

2.冷凍用培養基(2倍) : 培養基內加入三倍血清及15% DMSO，保存在冰箱中。

3. 冷凍管、保利龍制容器、鋁制ample支持棒。

[步驟]:

1.準備2 x 107cells/ml的細胞懸浮液。

2.冷凍用培養基(2倍) :以微溫水溶解DMSO，在培養基中混合為15% (v/v)。這是DMSO的二倍濃度之溶液。必須在進(jìn)行實(shí)驗前在行配制，配好后放在冰箱中，使用量必須和細胞懸浮液的量相等；使用時(shí)維持在4℃。

3.分裝: 在冷凍管管中分別加0.5ml (1/2冷凍管體積)冷凍用培養基(2倍)及2 x 10(7次方)cells/ml的細胞懸浮液；等量混合。將蓋子扭緊后，在管中部貼上膠帶密封。

4.記載卷標 : 用抗凍marker pen在冷凍管上寫(xiě)明細胞名稱(chēng)、代數、冷凍的年，月，日等所需要的項目。

5.放進(jìn)冷卻的保利龍容器中，而在- 80℃的超低溫槽中放置一個(gè)晚上。

6.放進(jìn)液態(tài)氮容器中及保存 : 在支持棒上裝上冷凍管，迅速地放進(jìn)容器內。

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