細胞培養常見(jiàn)的28個(gè)問(wèn)題（二）

15.如何檢測內毒素(熱源)水平？

LAL（Limulus Amebocyte Lysate）試驗是可用的最敏感和特異的檢測細菌內毒素的方法。Levin和Bang 發(fā)現細菌可引起鱟（Limulus polyphemus）血管內的凝集作用。內毒素啟動(dòng)一個(gè)細胞內酶原系統（絲氨酸蛋白酶級聯(lián)反應系統），通過(guò)修飾凝集素，產(chǎn)生一種透明的膠，LAL中的凝固蛋白，從而，形成不可溶的基質(zhì)。LAL試劑緩沖的鱟（血細胞）裂解物。

胎牛血清的內毒素檢測是在Grand Island，按照手冊上Gel-clot 方法進(jìn)行的。在對血清產(chǎn)品進(jìn)行內毒素檢測前，用無(wú)熱源的水1：10稀釋樣品。稀釋樣品沸水育5分鐘，以消除抑制劑。（通常，血液中的內毒素結合成份的出現會(huì )抑制凝膠過(guò)程，使內毒素不能與LAL反應。樣品預先熱處理可以消除這種抑制作用。）

16.我可以使用固體形式的Murashige Skog 培養基嗎？

如果使用固體形式的培養基，需要加入瓊脂。瓊脂加入前要先滅菌。應該避免MS培養基的直接滅菌，應該高壓滅菌瓊脂溶液，然后把融化的瓊脂溶液加入到MS培養基中。

17.20℃下配制的緩沖液，在較高或較低的溫度下PH值會(huì )改變嗎？

對于普通使用的緩沖液，PH值隨溫度變化而變化。

下表列出溫度改變10℃時(shí)，PH值的變化情況

例如 20℃下配制PH7.4 Tris緩沖液,40℃時(shí)PH值為 7.4-（2x0.310）＝6.78

緩沖系統 pKa/20℃ [Delta]pKa/10℃

Mes 6.15 -0.110

Ada 6.60 -0.110

Pipes 6.80 -0.085

Aces 6.90 -0.200

Bes 7.15 -0.160

Mops 7.20 -0.013

Tes 7.50 -0.200

Hepes 7.55 -0.140

Tricine 8.15 -0.210

Tris 8.30 -0.310

Bicine 8.35 -0.180

Glycylglycine 8.40 -0.280

18.室溫下(25℃)配制的Tris-HCl溶液，在37℃使用時(shí)PH值是多少？

緩沖液的PH值隨溫度變化而變化。下表列出了50mM Tris-HC 溶液在4℃，25℃，37℃時(shí)，不同的PH值。

4℃ 25℃ 37℃

8.1 7.5 7.2

8.2 7.6 7.3

8.3 7.7 7.4

8.4 7.8 7.5

8.5 7.9 7.6

8.6 8.0 7.7

8.7 8.1 7.8

8.8 8.2 7.9

8.9 8.3 8.0

9.0 8.4 8.1

9.1 8.5 8.2

9.2 8.6 8.3

9.3 8.7 8.4

9.4 8.8 8.5

19.昆蟲(chóng)細胞培養的最適PH值和滲透壓是多少？

生長(cháng)培養基的PH值對細胞的增值和病毒或重組蛋白的生產(chǎn)均會(huì )產(chǎn)生影響。對于大部分鱗翅類(lèi)昆蟲(chóng)細胞系，在PH值 6.0－6.4范圍的大部分應用效果良好。培養鱗翅類(lèi)昆蟲(chóng)細胞系時(shí)，培養基的最適滲透壓是 345－380mOsm/kg.。為保證可靠和持久的細胞培養方式，減少技術(shù)問(wèn)題，保持PH值和滲透壓在以上所列的范圍之內。

20.High Five細胞有任何其它名稱(chēng)嗎？

High Five細胞也被稱(chēng)為T(mén)richoplasia ni 5B1-4和BTI-TN-5B1-4。

21.PFHM-II 和HYBRIDOMA-SFM之間有什么差別？

PFHM-II (Protein-free Hybridoma Medium)是不包含有蛋白質(zhì)的單克隆抗體生產(chǎn)培養基。如果作為雜交瘤生產(chǎn)培養基使用，PFHM-II可能需要補充低水平的血清。HYBRIDOMA-SFM即是雜交瘤生產(chǎn)培養基，也是單克隆抗體生產(chǎn)培養基。它包含低水平的蛋白質(zhì)。

22.在High Five無(wú)血清培養基中去污劑的濃度是多少？

High Five無(wú)血清培養基中去污劑的濃度：0.025 g/L Tween-80，1.0 g/L Pluronic Poly-all。

23.High Five細胞用多大的密度凍存？

3.0x10E6 cells/ml

24.在我的果蠅培養基中發(fā)現形成白色沉淀，加熱后溶解。它是什么？對我的細胞有害嗎？

可能是谷氨酰胺沉淀，但是更可能是L-酪氨酸沉淀。培養基中谷氨酰胺的濃度比典型的2mM高6倍。酪氨酸的濃度比在RPMI 1640中高25倍，而且比谷氨酰胺更加難以溶解。沉淀也可能是不止一種成分的復合物。它可能是由于貯存在局部溫度較低的地方引起。只要沉淀在培養條件下可以溶解，對實(shí)驗不會(huì )有不利的影響。

25.如何從T25瓶中轉移sf9細胞？能用胰蛋白酶消化嗎？

我們強力推薦使用脫落細胞的方法，因為這項技術(shù)破壞性最小，生活力最高。正如手冊上所顯示，通過(guò)使用巴氏德吸液管，讓細胞上培養基流動(dòng)。作為一種選擇你也可以輕輕拍打培養瓶。只有在絕對必要的情況下，才使用胰酶消化細胞。

胰酶消化一個(gè)T25瓶的sf9細胞：

1. 去除培養基。

2. 用2ml 1xPBS（足以覆蓋細胞表面）洗滌細胞，去除PBS.

3. 加入2ml 1x胰酶EDTA（恰好覆蓋細胞表面）。

4. 37 ℃孵育5到10分鐘。在儀器下檢測看到5分鐘后它們正在向上移動(dòng)。

5. 向細胞中加入2ml 細胞培養液，移入錐形管，用2ml培養液洗瓶壁，移入同一錐形管中。（培養基中的FBS終止了胰酶的活性。）

6. 離心（1100rpm）沉淀細胞。去除培養基。

7. 用新的培養基重新懸浮細胞。傳代。

26.在Sf9, Sf21, 和high Five細胞懸浮培養時(shí)，肝素的使用量是多少？

為了防止懸浮培養細胞聚集的形成，使用肝素濃度為10單位/毫升細胞懸液。

27.如何評估ES細胞合格的胎牛血清？

使用D3 ES細胞。這是一個(gè)對于胎牛血清中生長(cháng)促進(jìn)、生長(cháng)抑制和分化因子非常敏感的細胞系。

相關(guān)生長(cháng)效率分析：

當ES細胞以非常低的密度傳入包含10％胎牛血清的生長(cháng)培養基中，檢測開(kāi)始和支持ES細胞克隆的能力。

細胞毒分析：

當以非常低的密度傳入包含30％胎牛血清的生長(cháng)培養基中，檢測ES細胞和feeder細胞的生長(cháng)能力。

相關(guān)形態(tài)學(xué)和分化分析：

檢測胎牛血清支持未分化ES細胞克隆的能力。通過(guò)堿性磷酸酶活性評估分化程度。未分化的ES細胞小顏色深紅粉紅，分化的細胞較大，豐滿(mǎn)，顏色較淺。

所有的分析在沒(méi)有ESGRO的情況下進(jìn)行的，培養基中出現ESGRO會(huì )掩蓋由胎牛血清所導致的問(wèn)題。（ESGRO或LIF經(jīng)常用來(lái)保持ES細胞處于未分化狀態(tài)。）

經(jīng)過(guò)培養發(fā)現，大約8批中有1批可以用來(lái)培養ES細胞。

28.在重新凍存sf9細胞前，它可以傳多少代？隨著(zhù)傳代的次數的增加，它的感染能力會(huì )降低嗎？

通常情況當細胞經(jīng)過(guò)30次傳代后，應該返回凍存。無(wú)論什么時(shí)候記數時(shí)，都應該檢查細胞活力。如果超過(guò)95％的細胞保持有活力和在大約30小時(shí)左右加倍，細胞仍然可以使用。如果活力和加倍時(shí)間下降，它們的感染力將不在是有效的。

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