硝化細菌的分離、培養和觀(guān)察

硝化細菌是生物界中一類(lèi)特殊的生產(chǎn)者，能進(jìn)行硝化作用參與氮素的轉化

 

儀器與試劑：

恒溫箱、高壓滅菌鍋、天平、量杯、玻棒、大試管、三角瓶（250毫升）、顯微鏡、白瓷板、α—萘胺試劑、二苯胺試劑、醋酸、磺胺酸，革蘭氏試劑、PH試紙、(NH4)2SO4、NaH2PO4、K2HPO4、Na2CO3、MnSO4•4H2O、MgSO4•7H2O、NaNO2、NaOH(0.1N)、HCl(0.1N)、濃H2SO4、蒸餾水。

 

實(shí)驗過(guò)程：

（一）   配制硝化細菌培養液：

NaNO2	1g
MgSO4·7H2O	0.03g
MnSO4·4H2O	0.01g
K2HPO4	0.75g
Na2CO3	1g
NaH2PO4	0.25g
蒸餾水	1000ml

培養液pH值用0.1NNaOH或0.1NH4Cl調至7.0～7.2。

 

（二）滅菌

將配制好的培養液分裝在大試管中，每管約15毫升，堵上包有紗布的棉塞，放在高壓滅菌鍋中，15磅30分鐘滅菌備用。

 

（三）樣品采集：

采用公園下層湖水約100毫升即可。

 

（四）接種：

用吸管吸取樣品，每支試管接1～2毫升樣品。

 

（五）培養：

置于28～30℃恒溫箱中靜置7～10天。

 

（六）結果測定：

 

1、配制試劑：

（1）α—萘胺試劑的配制：用天平稱(chēng)取α—萘胺5克于100毫升醋酸(5N)中，用玻棒攪拌溶解。

（2）二苯胺試劑的配制：用天平稱(chēng)取0.5克二苯胺溶于100毫升濃濃H2SO4中，再加入20毫升蒸餾水中攪拌稀釋。

 

2、NO2-的檢驗：

在瓷盤(pán)小孔內各加入1滴α-萘胺試劑，然后加少許試驗液，變紅色的為(+)，未變色(黃色)的為(-)。

 

3、NO3-的檢驗：

（1）先除去培養物中的NO2-：方法是在培養物中加入醋酸5～8滴，使之酸化，再加入數�；前匪�，當停止放出氣體時(shí)，再加入一�；前匪�，此過(guò)程中NO2-轉化為N2而逸出。用α-萘胺試劑檢查，如不出現紅色，證明培養物中不含NO2-。

（2）檢驗NO3-的產(chǎn)生：方法是吸取培養物少許于白瓷板凹窩中，滴入二苯胺試劑，如有藍色出現，即證明有NO3-的積累。

 

（七）富集培養：

將測定為(+)的菌液接入裝有100毫升培養液的250毫升三角瓶中(培養液已滅過(guò)菌)，置28～30℃恒溫箱中培養，待生長(cháng)后測定結果為(+)再接另瓶培養液中進(jìn)行培養。如此經(jīng)多次移接，可使培養液的亞硝化細菌和硝化細菌逐步增多。

 

（八）觀(guān)察：

將菌液制成涂片，經(jīng)革蘭氏染色后，顯微鏡下觀(guān)察菌體形態(tài)。