包涵體的純化（五）

五、包涵體的純化

復性以后的蛋白質(zhì)的純化策略與可溶性蛋白質(zhì)相似，這里不再贅述。（注：當然也可以先純化然后再復性———一般多采用凝膠柱，或者純化與復性同步進(jìn)行———比如柱上復性。）

2、綜述

蛋白的復性是一個(gè)世界性的難題，沒(méi)有通用的方法，甚至沒(méi)有靠得住的規律，只能試。

包涵體表達的蛋白的復性包涵體表達的蛋白的復性

包涵體：

包涵體是指細菌表達的蛋白在細胞內凝集，形成無(wú)活性的固體顆粒。

包涵體的組成與特性：

一般含有50%以上的重組蛋白，其余為核糖體元件、RNA聚合酶、外膜蛋白ompC、ompF和ompA等，環(huán)狀或缺口的質(zhì)粒DNA，以及脂體、脂多糖等，大小為0.5-1um，難溶與水，只溶于變性劑如尿素、鹽酸胍等。

包涵體的形成：

主要因為在重組蛋白的表達過(guò)程中缺乏某些蛋白質(zhì)折疊的輔助因子，或環(huán)境不適，無(wú)法形成正確的次級鍵等原因形成的。

1、表達量過(guò)高，研究發(fā)現在低表達時(shí)很少形成包涵體，表達量越高越容易形成包涵體。原因可能是合成速度太快，以至于沒(méi)有足夠的時(shí)間進(jìn)行折疊，二硫鍵不能正確的配對，過(guò)多的蛋白間的非特異性結合，蛋白質(zhì)無(wú)法達到足夠的溶解度等。

2、重組蛋白的氨基酸組成：一般說(shuō)含硫氨基酸越多越易形成包涵體，而脯氨酸的含量明顯與包涵體的形成呈正相關(guān)。

3、重組蛋白所處的環(huán)境：發(fā)酵溫度高或胞內pH接近蛋白的等電點(diǎn)時(shí)容易形成包涵體。

4、重組蛋白是大腸桿菌的異源蛋白，由于缺乏真核生物中翻譯后修飾所需酶類(lèi)，致使中間體大量積累，容易形成包涵體沉淀。因此有人采用共表達分子伴侶的方法以增加可溶蛋白的比例。

包涵體表達的有利因素：

1、可溶性蛋白在細胞內容易受到蛋白酶的攻擊，包涵體表達可以避免蛋白酶對外源蛋白的降解。

2、降低了胞內外源蛋白的濃度，有利于表達量的提高。

3、包涵體中雜蛋白含量較低，且只需要簡(jiǎn)單的低速離心就可以與可溶性蛋白分離，有利于分離純化。

4、對機械攪拌和超聲破碎不敏感，易于破壁，并與細胞膜碎片分離。

破菌：

1、機械破碎

2、超聲破碎

3、化學(xué)方法破碎

分離：

1、離心：5000-20000g15min離心，可使大多數包涵體沉淀，與可溶性蛋白分離。

2、過(guò)濾或萃取方法：

洗滌：

由于脂體及部分破碎的細胞膜及膜蛋白與包涵體粘連在一起，在溶解包涵體之前要先洗滌包涵體，通常用低濃度的變性劑如2M尿素在50mM TrispH7.0-8.5左右,1mMEDTA中洗滌。此外可以用溫和去垢劑TritonX-100洗滌去除膜碎片和膜蛋白。

溶解：

常用的變性劑有尿素（8M）、鹽酸胍（GdnHCl6-8M），通過(guò)離子間的相互作用，破壞包涵體蛋白間的氫鍵而增溶蛋白。其中尿素的增溶效果少差，異氰硫酸胍（GdnSCN）最強。

去垢劑：如強的陰離子去垢劑SDS，可以破壞蛋白內的疏水鍵，可以增溶幾乎所有的蛋白。問(wèn)題是由于SDS無(wú)法徹底的去除而不允許在制藥過(guò)程中使用。

極端pH：可以破壞蛋白的次級鍵從而增溶蛋白。如有人在pH>9.0溶解牛生長(cháng)激素和牛凝乳蛋白酶包涵體。有些蛋白可以溶解在60mMHCl中。這些方法只適合于少部分蛋白的增溶。

變性劑的使用濃度和作用時(shí)間：一般在偏堿性性的環(huán)境中如pH8.0-9.0，尿素在堿性環(huán)境中不穩定，一般不要超過(guò)pH1.0。有些蛋白只能用鹽酸胍如IL-4。增溶時(shí)一般室溫過(guò)夜，但鹽酸胍在37度1小時(shí)便可以使多數蛋白完全變性溶解。

還原劑：

由于蛋白間二硫鍵的存在，在增溶時(shí)一般使用還原劑。還原劑的使用濃度一般是50-100mM2-BME或DTT，也有文獻使用5mM濃度。在較粗放的條件下，可以使用5ml/l的濃度。還原劑的使用濃度與蛋白二硫鍵的數目無(wú)關(guān)，而有些沒(méi)有二硫鍵的蛋白加不加還原劑無(wú)影響，如牛生長(cháng)激素包涵體的增溶。對于目標蛋白沒(méi)有二硫鍵某些包涵體的增溶，有時(shí)還原劑的使用也是必要的，可能由于含二硫鍵的雜蛋白影響了包涵體的溶解。

復性：

通過(guò)緩慢去除變性劑使目標蛋白從變性的完全伸展狀態(tài)恢復到正常的折疊結構，同時(shí)去除還原劑使二硫鍵正常形成。一般在尿素濃度4M左右時(shí)復性過(guò)程開(kāi)始，到2M左右時(shí)結束。對于鹽酸胍而言，可以從4M開(kāi)始，到1.5M 時(shí)復性過(guò)程已經(jīng)結束。

復性中常采用的方法有：

稀釋復性：直接加入水或緩沖液，放置過(guò)夜，缺點(diǎn)是體積增加較大，變性劑稀釋速度太快，不易控制。

透析復性：好處是不增加體積，通過(guò)逐漸降低外透液濃度來(lái)控制變性劑去除速度，有人稱(chēng)易形成沉淀，且不適合大規模操作，無(wú)法應用到生產(chǎn)規模。

超濾復性：在生產(chǎn)中較多的使用，規模較大，易于對透析速度進(jìn)行控制，缺點(diǎn)是不適合樣品量較少的情況，且有些蛋白可能在超濾過(guò)程中不可逆的變性。

柱上復性：是最近研究較多并成功的在生產(chǎn)中應用的一種復性方法，如華北制藥的G-CSF復性據說(shuō)是通過(guò)柱上復性進(jìn)行的。常用于復性的層析方法有SEC、HIC等。

還原劑的去除：

還原劑一般和變性劑的去除一起慢慢的氧化去除，使二硫鍵慢慢形成。但是由于二硫鍵的形成并不是蛋白質(zhì)正確折疊所必須的，可以考慮在變性劑完全去除之后，在去除還原劑使已經(jīng)按照正確的結構相互接近的巰基間形成正確的二硫鍵。

常用的氧化方法有：

空氣氧化法：在堿性條件下通空氣，或者加入二價(jià)銅離子，能夠取得更好的效果，缺點(diǎn)是不易控制氧化還原電勢。

氧化還原電對（redox）：常采用GSSG/GSH，通過(guò)調整兩者的比例來(lái)控制較精確的氧化還原電勢，也可以在添加了還原劑如BME、DTT的增溶液中直接加入GSSG,如：5mMGSSG/2mM DTT=GSH/GSSG(1.33/1)。

復性的效率：

復性是一個(gè)非常復雜的過(guò)程，除與蛋白質(zhì)復性的過(guò)程控制相關(guān)外，還很大程度上與蛋白質(zhì)本身的性質(zhì)有關(guān)，有些蛋白非常容易復性，如牛胰RNA酶有12對二硫鍵，在較寬松的條件下復性效率可以達到95%以上，而有一些蛋白至今沒(méi)有發(fā)現能夠對其進(jìn)行復性的方法如IL-11，很多蛋白的復性效率只有百分之零點(diǎn)幾。一般說(shuō)來(lái)，蛋白質(zhì)的復性效率在20%左右。影響復性效率的因素有蛋白質(zhì)的復性濃度，變性劑的起始濃度和去除速度、溫度、pH、氧化還原電勢、離子強度、共溶劑和其他添加劑的存在與否等。

復性過(guò)程的添加劑：

1、共溶劑：如PEG6000-20000，據說(shuō)可以可逆的修飾折疊中間體的疏水集團，此外由于阻止了蛋白質(zhì)分子間的相互接觸的機會(huì )，也可能對復性效率的提高起作用。一般的使用濃度在0.1%左右，具體條件可根據實(shí)驗條件確定。

2、二硫鍵異構酶（PDI）和脯氨酸異構酶（PPI）：PDI可以使錯配的二硫鍵打開(kāi)并重新組合，從而有利于恢復到正常的結構，此外在復性過(guò)程中蛋白質(zhì)的脯氨酸兩種構象間的轉變需要較高能量，常常是復性過(guò)程中的限速步驟，而PPI的作用是促進(jìn)兩種構象間的轉變，從而促進(jìn)復性的進(jìn)行。

3、分子伴侶，即熱休克蛋白（HSP），是一種沒(méi)有蛋白質(zhì)特異性的促進(jìn)折疊的蛋白因子，研究發(fā)現很多蛋白在缺乏分子伴侶時(shí)無(wú)法自己正確的折疊。有人構建了與伴侶分子共同表達的菌株，據說(shuō)效果不錯。不過(guò)在生產(chǎn)中還沒(méi)有看到2和3的應用的例子。

4、0.4-0.6ML-Arg：成功的應用于很多蛋白如t-PA的復性中，可以抑制二聚體的形成。

5、甘油等：增加黏度，減少分子碰撞機會(huì )，一般使用濃度在%5-30%。

6、一定的鹽濃度，可能是為了降低某些帶電集團間的斥力，有利于蛋白質(zhì)的折疊。

7、輔助因子：添加蛋白質(zhì)活性狀態(tài)必須的輔助因子如輔酶輔基等或蛋白配體等很多時(shí)候對蛋白質(zhì)正確的折疊是有利的。

8、色譜法：通過(guò)將目標蛋白結合到層析柱上，減少蛋白分子間的相互影響，該方法得到越來(lái)越多的應用，常用的色譜有SEC、HIC、IEC、IMAC等。

當然，雖然有很多所謂的理性的復性方案設計，目前的復性工作更多的是一個(gè)經(jīng)驗的過(guò)程，沒(méi)有一種通用的方法可以套用。

復性時(shí)的蛋白濃度：

一般使用濃度為0.1-1mg/ml，太高的濃度容易形成聚體沉淀，太低的濃度不經(jīng)濟，而且很多蛋白在低濃度時(shí)不穩定，很容易變性。

復性效果的檢測：

根據具體的蛋白性質(zhì)和需要，可以從生化、免疫、物理性質(zhì)等方面對蛋白質(zhì)的復性效率進(jìn)行檢測。

1、凝膠電泳：一般可以用非變性的聚丙烯酰胺凝膠電泳可以檢測變性和天然狀態(tài)的蛋白質(zhì)，或用非還原的聚丙烯酰胺電泳檢測有二硫鍵的蛋白復性后二硫鍵的配對情況。

2、光譜學(xué)方法：可以用紫外差光譜、熒光光譜、圓二色性光譜（CD）等，利用兩種狀態(tài)下的光譜學(xué)特征進(jìn)行復性情況的檢測，但一般只用于復性研究中的過(guò)程檢測。

3、色譜方法：如IEX、RP-HPLC、CE等，由于兩種狀態(tài)的蛋白色譜行為不同。

4、生物學(xué)活性及比活測定：一般用細胞方法或生化方法進(jìn)行測定，較好的反映了復性蛋白的活性，值得注意的是，不同的測活方法測得的結果不同，而且常常不能完全反映體內活性。

5、黏度和濁度測定：復性后的蛋白溶解度增加，變性狀態(tài)時(shí)由于疏水殘基暴露，一般水溶性很差，大多形成可見(jiàn)的沉淀析出。

6、免疫學(xué)方法：如ELISA、WESTERN等，特別是對結構決定簇的抗體檢驗，比較真實(shí)的反映了蛋白質(zhì)的折疊狀態(tài)。

幾個(gè)復性的實(shí)例：

1、MHCII JBC 269（47）：1994

增溶：16-40mg Protein,8MGdnHCl,16-32mM DTT,1mM EDTA,50mM Tris pH8.037度1hr.

復性：8-16fold dilution to1-5mg/ml Protein.

2、增溶：10mM DTT,0.1%

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