包涵體的純化（四）

四、包涵體的復性

1、包涵體如何復性

包涵體的復性主要有兩種方式：

1，稀釋溶液，但是操作的液體量大，蛋白稀釋

2，透析，超濾或電滲透析去除變性劑

其中透析很適合實(shí)驗室應用，但是時(shí)間長(cháng)。另外，如果蛋白質(zhì)右兩個(gè)以上的2硫鍵，很可能錯誤形成配對，應用還原劑。還有，復性的具體方法還要根據前期試驗及篩選來(lái)確定！

另外，你用多大體積的透析緩沖液？可能不夠，要更換幾次

你家了多少蛋白呀 ？蛋白量過(guò)大也會(huì )使復性困難。

你用的透析代是否是新的，處理過(guò)沒(méi)有？新代有化學(xué)雜質(zhì)！

最后，有些復性過(guò)程就是還有沉淀（透析方法的缺點(diǎn)）看看溶液中蛋白含量，說(shuō)不定已經(jīng)夠用了~~

包涵體的復性還要注意以下幾點(diǎn)：

1.首先要獲得較高純度的包涵體。

2.包涵體溶解要徹底，一般應使溶解液體量較大，不要怕蛋白被稀釋?zhuān)�要有助溶措施�?

3.透析前后均要離心

4.透析不能太快.

5.純化的最佳條件要摸索。

小技巧：

1）包含體要徹底洗滌干凈，洗滌液中加入適量Triton-X100.

2) 包含體溶解后裝入透析袋在復性液中復性

3）復性液的組成很有講究，本人使用 Oxidised Glutathione/ Reduced Glutathione 還加入一定的L-Arginine-Hydrochloride 12-24h

4) 復性完畢在低濃度的緩沖液中連續緩慢透析12-24h

5) 復性率的測定 據變性蛋白和非變性蛋白的光學(xué)性質(zhì)不同測定（望有經(jīng)驗的戰友能更詳細地講解）

6）TritionX100、SDS這一類(lèi)去垢劑最后不易去除，在制藥行業(yè)中一般不允許采用。好像SDS最后殘留量不能大于0.5%吧，忘了。

我用Triton洗滌有些包涵體效果不是很好。包涵體洗滌是純化極為重要的一步，改變培養條件，再洗滌包涵體，有時(shí)可以在上柱前已經(jīng)只剩下3-4條雜帶，這樣后續的純化就很方便了。因為色譜柱的純化條件比較難optimize。

這段文字可以參考：

用Novagen公司《pET System Manual》提供的方法，分別進(jìn)行細菌滲透休克，超聲波裂解，研究融合蛋白在細胞周質(zhì)，細胞質(zhì)和包涵體中的分布。

滲透休克 用1.2.3方法誘導細菌（10ml體積），測菌液OD600，10000 r/min離心0.5 min去上清，加入滲透休克溶液1（V1= OD 600×V2/5，V1為滲透休克溶液1，V2為培養新鮮菌液），冰浴10 min，10000 r/min離心0.5 min，去上清。加V1體積滲透休克溶液2重懸，搖動(dòng)冰浴10 min，10000 r/min離心0.5 min，保存上清、細菌沉淀。作如下處理：上清用三氯乙酸(TCA Trichloroacetic acid) 沉淀，加1/10體積100% TCA (w/v)，渦漩15 sec.，冰浴10 min，13000 r/min離心5 min，100 ul丙酮洗滌沉淀，干燥1 h，加V1/2體積1× PBS（pH 10）溶解，-20℃保存，取10 ul加入等體積2×SB，進(jìn)行12% SDS-PAGE電泳分析，UNIUER SAL HooD-S.N. 75s 成像系統照相。

超聲波裂解細菌 滲透休克細菌沉淀加1/10培養體積20 mM Tris-HCl（pH 7.5，0℃）重懸，冰浴，超聲波裂解，20%工作選擇，脈沖粉碎1 min，然后13000 r/min離心5 min，-20℃保存上清、細菌沉淀。上清進(jìn)行TCA沉淀，處理同上。沉淀用Protein Extraction Reagent（Ni-NTAHi Bind Purification Kit BugBuster. 提供 ）按 Novagen公司《pE

提供方法反復處理，洗滌包涵體。包涵體按培養菌100×OD600/3 ul體積加1% SDS溶解，加等體積2×SB，進(jìn)行12% SDS-PAGE電泳分析，進(jìn)行蛋白條帶灰度掃描，計算融合蛋白Trx-PrPC27-30占細菌總蛋白的相對含量。

1.2.7重組融合蛋白的純化

PrP-pET-32a（+）轉化表達菌E.coli BL21（DE3），TB培養基中，25℃，AMP 200 ug/ml，搖床（250 r／min）培養至OD600約為1.5，更換等體積新鮮TB培養基，加入IPTG至終濃度1 mM，AMP 200 ug/ml，25℃，4 h，4000 g離心收集菌體。按 Ni-NTA HiBind Purification Kit使用說(shuō)明溶解包涵體，純化融合蛋白。

或使用筆者改進(jìn)方法，將Ni-NTA HiBind Purification Kit使用說(shuō)明中Buffer D改成Wash-Buffer，Buffer-E改成Elute-Buffer，最后用Buffer-E重生Ni-NTA HiBind Rasin，Binding- Buffer平衡以后加50%酒精保存，以免長(cháng)菌。

洗脫所得蛋白用TCA沉淀，處理同上，得融合蛋白Trx-PrPC27-30，凍干保存。然后12% SDS-PAGE凝膠電泳分析。

3、包涵體復性2

精氨酸可助溶，但精氨酸是代謝產(chǎn)物高濃度對人可能不好。

另外甘氨酸、纈氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、精氨酸有助溶作用。你可以試一試。

對于疏水蛋白的可溶表達，可以降低誘導溫度（可以試試4度誘導過(guò)夜）和IPTG的量，降低蛋白的表達速度，從而減少包涵體形成的速度，增加正確折疊蛋白的量�；蛘邠Q成GST融合表達載體，GST可以增加后面融合蛋白的可溶表達。我的蛋白包涵體在經(jīng)變性純化后透析復性過(guò)程中，在透析液中加入了1%的甘氨酸和5%的甘油，有一定的助溶效果。我想對于你的情況，由于含有二硫鍵，還要加入一定比例的谷胱甘肽，才能形成正確的二硫鍵。復性是一個(gè)很難捉摸的過(guò)程，不同蛋白的復性條件也各不相同。

5、包涵體復性問(wèn)題

包含體復性三大原則：

1。低濃度

2。平緩梯度

3。低溫

有蛋白析出最大的可能型是：蛋白濃度太高，建議你稀釋以后再作透析。

此外，透析的鹽濃度（比如ura）要平緩降低：8m-6m-4m-2m-pbs-H2O。

6、包涵體復性形成聚集物

關(guān)鍵是蛋白在復性過(guò)程中凝聚了以后，調節PH可以使其溶解，但是這樣復性好的蛋白有沒(méi)有活性還是問(wèn)題，雖然樣品溶解了，但活性不高或沒(méi)有也不行呀！

7、復性中蛋白析出！

出現蛋白析出，肯定是條件變化太劇烈了。復性應該采取復性液濃度和PH值逐漸變化的方法，例如根據你包含體的溶液成分，每隔1個(gè)PH或濃度值配置一種溶液，逐步透析到正常。此外透析時(shí)必須濃度極低，條件溫和，使蛋白質(zhì)能夠正確折疊。但是復性的比率應該很低。

若加變性劑尿素可加到2M，鹽酸胍可加到1-1.5M；

另外可將甘油濃度增加，范圍可在≤30%，且在復性樣品中也可加適量甘油；一些拙見(jiàn)。

8、包涵體復性液配方

對于包涵體復性，一般在尿素濃度4M左右時(shí)復性過(guò)程開(kāi)始，到2M 左右時(shí)結束。對于鹽酸胍而言，可以從4M開(kāi)始，到1.5M 時(shí)復性過(guò)程已經(jīng)結束。TRIS系統和PBS系統都沒(méi)有明確的規定，這些需要你在實(shí)驗過(guò)程中不斷試驗，確定合適的緩沖系統；不過(guò)復性過(guò)程主要是注意以下幾個(gè)問(wèn)題：

1）最適pH值范圍為8.0-9.0之間；

2) 溫度適宜選擇4℃；

3）復性過(guò)程蛋白濃度不宜過(guò)大，一般為0.1-0.2mg/mL；

4) 復性時(shí)間一般為24-36小時(shí)；

5) 低分子化合物 如L-Arg有助于增加復性中間產(chǎn)物的溶解度；脲、鹽酸胍、烷基脲、以及碳酸酰胺類(lèi)等，在非變性濃度下是很有效的促進(jìn)劑，都可阻止蛋白聚集；Tris對蛋白質(zhì)復性有促進(jìn)作用；EDTA可以防止蛋白降解；

6) 氧化還原體系，如GSH/GSSG、DTT/GSSG、DTE/GSSG等.。

還有就是你的蛋白質(zhì)的特性

9、什么叫復性成功

復性效果的檢測：

根據具體的蛋白性質(zhì)和需要，可以從生化、免疫、物理性質(zhì)等方面對蛋白質(zhì)的復性效率進(jìn)行檢測。

1，凝膠電泳：一般可以用非變性的聚丙烯酰胺凝膠電泳可以檢測變性和天然狀態(tài)的蛋白質(zhì)，或用非還原的聚丙烯酰胺電泳檢測有二硫鍵的蛋白復性后二硫鍵的配對情況。

2，光譜學(xué)方法：可以用紫外差光譜、熒光光譜、圓二色性光譜（CD）等，利用兩種狀態(tài)下的光譜學(xué)特征進(jìn)行復性情況的檢測，但一般只用于復性研究中的過(guò)程檢測。

3，色譜方法：如IEX、RP-HPLC、CE等，由于兩種狀態(tài)的蛋白色譜行為不同，

4，生物學(xué)活性及比活測定：一般用細胞方法或生化方法進(jìn)行測定，較好的反映了復性蛋白的活性，值得注意的是，不同的測活方法測得的結果不同，而且常常不能完全反映體內活性。

5，黏度和濁度測定：復性后的蛋白溶解度增加，變性狀態(tài)時(shí)由于疏水殘基暴露，一般水溶性很差，大多形成可見(jiàn)的沉淀析出。

6，免疫學(xué)方法：如ELISA、WESTERN等，特別是對結構決定簇的抗體檢驗，比較真實(shí)的反映了蛋白質(zhì)的折疊狀態(tài)。

在正常的生理條件下，組成蛋白質(zhì)的多肽鏈都能以獨特的方式進(jìn)行折疊，形成自己特有的空間結構，以執行某一些生命活動(dòng)。當外界環(huán)境改變時(shí)，可能造成基因突變和蛋白質(zhì)序列改變，錯誤剪接和運輸，錯誤折疊和異常聚積，形成對機體有害的反應，引起構象病的發(fā)生和無(wú)生物活性、不可溶的包涵體形成。目前對包涵體形成和復性過(guò)程中發(fā)生聚集的機制尚不清楚，許多已建立的高效復性方法是在反復實(shí)驗和優(yōu)化的基礎上建立的，且沒(méi)有普遍性，但從這許許多多的個(gè)例中發(fā)現了一些規律：如聚集的發(fā)生是由鏈間的疏水相互作用介導、聚集具有相對特異性、折疊中間體可能具有不同的作用等等，并利用這些知識建立了一些重組蛋白質(zhì)高效復興性的方法。相信隨著(zhù)結構生物學(xué)、生物信息學(xué)、蛋白質(zhì)工程學(xué)及相關(guān)新技術(shù)和新設備的發(fā)展和完善，在不久的將來(lái)，預測和設計最佳復性方案將成為可能。

另外，還向這位戰友薦一文章，有關(guān)包涵體蛋白復性的文章！

10、怎樣鑒定融合蛋白復性是否成功

問(wèn)：最近在做GST融合蛋白的純化，由于目的蛋白主要存在于包涵體中，所以在變性條件下將包涵體溶解，經(jīng)復性，透析后用GSH sepharose 4B純化，結果得到了比較純的融合蛋白，這是否說(shuō)明GST的活性已得到恢復（因為能與GSH結合），請問(wèn)這種情況下，是否能代表我的目的蛋白的活性也得到了恢復？由于我的目的蛋白只是一個(gè)蛋白的某一段，不具有酶活性，也不是什么受體之類(lèi)的，所以不知如何鑒定它的活性。

如果我得到的是變性的融合蛋白，那么用于制備多抗或者單抗會(huì )有影響嗎？

如果我的融合蛋白是可溶性的，那么用GSH sepharose 4B純化得到的融合蛋白可以直接用于制備多抗嗎？溶液中的GSH，Tis等成分對免疫動(dòng)物有影響嗎？是否需要透析除取這些成分才能去免疫動(dòng)物呢？

答：1）。不可以。GST 具體多大忘記了，但做為T(mén)AG 使用的蛋白一般是很小的一段AA，可以用相對應的抗體做PULL DOWN，親和純化等。但蛋白的活性是需要構象存在的，一小段TAG 空間結構幾乎沒(méi)有，就算是沒(méi)有恢復活性的蛋白也可以與這小段AA 對應的抗體結合。

2）。變性蛋白只是天然蛋白伸直的了產(chǎn)物，用來(lái)免疫動(dòng)物具有更強的抗原性。只是天然蛋白中被包在內部的抗原決定簇也會(huì )暴露出來(lái)，如果用該變性抗原制備的抗體來(lái)檢測變性抗原是可以的，如果用來(lái)檢測天然蛋白，可能會(huì )有假陽(yáng)性。做單抗也可以，同樣道理，篩選出的單抗可能對抗的抗原決定簇處于天然抗原的內部，是否能用還要看將來(lái)該單抗用來(lái)干什么。

3）。免疫動(dòng)物要求抗原體種盡量小。在這種小體積的情況下，緩沖液里的小分子成分只要沒(méi)毒影響就不大，可以不用考慮。

4） GST為26kd,你得到的蛋白活性應通過(guò) 目的蛋白功能分析才能驗證是否復性。GST融合蛋白可以免疫動(dòng)物，但抗體純化須用GSH-sepharose 4B 和蛋白A或G進(jìn)一步純化，去掉抗GST抗體，如果你的目的蛋白很大，可以凝血酶切割除去 ＧＳＴ，再免疫動(dòng)物.GSH,Tris 是小 分子，沒(méi)影響。

5） 既然目的蛋白沒(méi)有活性，何來(lái)得活性鑒定，復性是否成功，就主要是看是否恢復到原來(lái)特有的三級結構，這就要看你目的蛋白的特異性，和天然的目的蛋白片斷進(jìn)行比較，看其復性是否徹底，這必須有個(gè)對照，才能知道復性是否完全。不知道你得到目的蛋白有什么用處，如果是用來(lái)做抗原，就沒(méi)有必要進(jìn)行活性鑒定了。

變性的融合蛋白做抗原是沒(méi)有影響的，gst的分子量是26kda，當然，如果將融合伴侶除去，抗體的特異性會(huì )要更好一些，如果不除，影響也不會(huì )很大。最好進(jìn)行透析，除去溶液中的雜物質(zhì)，但是Tris沒(méi)有什么關(guān)系，其就如同PBS一樣，本身是緩沖體系，不會(huì )對免疫造成太大影響。

6） 做抗原的話(huà)，變性了沒(méi)關(guān)系的；純化后可以直接免疫動(dòng)物，我們這就有人做，不過(guò)他是用的His融合表達；掛著(zhù)GST挺好的，不切也行，蛋白大些豈不是抗原性更強些

另外，你看沒(méi)看過(guò)菌液上清里的蛋白量？那里可能有許多的有活性的蛋白呀！

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