包涵體的純化（三）

三、關(guān)于包涵體的溶解：

1、 請教GST包涵體溶解

直接用8M的脲或 6M胍融解，取上清，測濃度。直接稀釋后包被檢測相應抗體。（由于快速稀釋相當于復性過(guò)程，產(chǎn)物用于檢測沒(méi)有問(wèn)題的）

我所用的包涵體提取方法：

1．PBS或生理鹽水洗滌誘導后菌體，Buffer A重懸菌體，超聲波破碎至清亮

２．４度，１００００rpm離心１０分鐘，棄上清

３．用ＰＢＳ或生理鹽水洗滌沉淀２－３次

４．往沉淀中加１９．７ml Buffer A及０．３ml�。玻埃サ模樱耍蹋ㄊ�二烷基肌氨酸鈉）貯存液，劇烈攪動(dòng)，使其緩慢溶解，室溫靜置３０分鐘至２小時(shí)

５．４度，１００００rpm離心１０分鐘，取上清

６．加２０％ＰＥＧ４０００�。玻保皍l至終濃度為０．２％，加５０mM的氧化型谷胱甘肽４２０ul至終濃度為１mM,加100mM的還原型谷胱甘肽４２０ul至終濃度為２mM,靜置３０分鐘至２小時(shí)（亦可４度復性過(guò)夜）

７以ＰＢＳ（pH8.0)或ＴＥ（pH8.0)透析，取出－２０度保存備用

！Buffer A配方：

　　　Tris-base 50mM

EDTA 0.5mM

NaCl 50mM

甘油　　5%

DTT 5mM

2、包涵體的溶解

十二烷基肌氨酸鈉與十二烷基肌氨酸在溶解包涵體時(shí)，可不可以互相代替？可以替換，調pH不久沒(méi)什么區別了嗎；兩者的功能團相同，pH不同，前者鈉鹽便于保存罷了

3、有關(guān)包涵體的溶解問(wèn)題

強的變性劑如尿素（6-8M）、鹽酸胍（GdnHCl 6M），是通過(guò)離子間的相互作用，打斷包涵體蛋白質(zhì)分子內和分子間的各種化學(xué)鍵，使多肽伸展，一般來(lái)講，鹽酸胍優(yōu)于尿素，因為鹽酸胍是較尿素強的變性劑，它能使尿素不能溶解的包涵體溶解，而且尿素分解的異氰酸鹽能導致多肽鏈的自由氨基甲�；�，特別是在堿性pH值下長(cháng)期保溫時(shí)。SDS、正十六烷基三甲基銨氯化物、Sarkosyl等是去垢劑，可以破壞蛋白內的疏水鍵，也可溶解一些包涵體蛋白質(zhì)。另外，對于含有半胱氨酸的蛋白質(zhì)，分離的包涵體中通常含有一些鏈間形成的二硫鍵和鏈內的非活性二硫鍵。還需加入還原劑，如巰基乙醇、二硫基蘇糖醇（DTT）、二硫赤蘚糖醇、半胱氨酸。對于目標蛋白沒(méi)有二硫鍵某些包涵體的增溶，有時(shí)還原劑的使用也是必要的，可能由于含二硫鍵的雜蛋白影響了包涵體的溶解。

4、8M尿素溶解的包涵體溶液應如何保存?

我在4度放了半個(gè)月，目前沒(méi)出什么問(wèn)題

5、8M尿素溶解的包涵體溶液在室溫下可以放多久而不出現問(wèn)題?

BI溶液在室溫放置48小時(shí)，可能會(huì )對目的蛋白有影響，因為尿素在堿性條件下可使一些氨基酸�；�化，因而早些處理BI溶液比較好。具體有什么影響我也不是很清楚。

6、GST融合蛋白形成包含體不溶，咋辦？

GST融合蛋白應該不能用尿素等作用太強的變性劑，否則GST融合蛋白是不能與beads相結合的

GST的Beads是應用酶與底物結合的原理，所以要去除處理因素后才好結合，不知你的溫和的去污劑是什么？

做完裂解之后加Triton　X－100輕搖３０min，蛋白溶解的會(huì )多些！

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