包涵體的純化（一）

關(guān)于包涵體的純化是一個(gè)令人頭疼的問(wèn)題，包涵體的復性已經(jīng)成為生物制藥的瓶頸，關(guān)于包涵體的處理一般包括這么幾步：菌體的破碎、包涵體的洗滌、溶解、復性以及純化，內容比較龐雜。

一、菌體的裂解

1、怎樣裂解細菌？

細胞的破碎方法

1.高速組織搗碎：將材料配成稀糊狀液，放置于筒內約1/3體積，蓋緊筒蓋，將調速器先撥至最慢處，開(kāi)動(dòng)開(kāi)關(guān)后，逐步加速至所需速度。此法適用于動(dòng)物內臟組織、植物肉質(zhì)種子等。

2.玻璃勻漿器勻漿：先將剪碎的組織置于管中，再套入研桿來(lái)回研磨，上下移動(dòng)，即可將細胞研碎，此法細胞破碎程度比高速組織搗碎機為高，適用于量少和動(dòng)物臟器組織。

3.超聲波處理法：用一定功率的超聲波處理細胞懸液，使細胞急劇震蕩破裂，此法多適用于微生物材料，用大腸桿菌制備各種酶，常選用50-100毫克菌體/毫升濃度，在1KG至10KG頻率下處理10-15分鐘，此法的缺點(diǎn)是在處理過(guò)程會(huì )產(chǎn)生大量的熱，應采取相應降溫措施，時(shí)間以及超聲間歇時(shí)間、超聲時(shí)間可以自己調整，超聲完全了菌液應該變清亮，如果不放心可以在顯微鏡下觀(guān)察。對超聲波及熱敏感的蛋白和核酸應慎用。

4.反復凍融法：將細胞在-20度以下冰凍，室溫融解，反復幾次，由于細胞內冰粒形成和剩余細胞液的鹽濃度增高引起溶脹，使細胞結構破碎。

5.化學(xué)處理法：有些動(dòng)物細胞，例如腫瘤細胞可采用十二烷基磺酸鈉（SDS）、去氧膽酸鈉等細胞膜破壞，細菌細胞壁較厚，可采用溶菌酶處理效果更好，我用的濃度一般為1mg/ml。

無(wú)論用哪一種方法破碎組織細胞，都會(huì )使細胞內蛋白質(zhì)或核酸水解酶釋放到溶液中，使大分子生物降解，導致天然物質(zhì)量的減少，加入二異丙基氟磷酸（DFP）可以抑制或減慢自溶作用；加入碘乙酸可以抑制那些活性中心需要有疏基的蛋白水解酶的活性，加入苯甲磺酰氟化物（PMSF）也能清除蛋白水解酶活力，但不是全部，而且應該在破碎的同時(shí)多加幾次；另外，還可通過(guò)選擇pH、溫度或離子強度等，使這些條件都要適合于目的物質(zhì)的提取。

這是標準配方:

裂解液：50mM Tris-HCl(pH8.5~9.0), 2mM EDTA, 100mM NaCl, 0.5% Triton X-100, 1mg/ml溶菌酶。(溶菌酶在這個(gè)pH范圍內比較好發(fā)揮作用)

但我個(gè)人的經(jīng)驗是:如果你裂解細菌是為了提取蛋白的話(huà),而且蛋白的分子量又小于20kd的話(huà),盡量減少溶菌酶的用量,會(huì )引入溶菌酶這種雜蛋白.一般配60ml裂解液用藥匙匙柄盛一點(diǎn)就夠.判斷裂解好壞的標準是,溶液很粘.

protocol是10ml-50ml緩沖液(菌體洗滌液,裂解液等)/1g濕菌體.

如果只做一個(gè)鑒定,我覺(jué)得100-200ml菌就夠了.

但凡超聲,我都用60ml裂解液,因為我們的超聲儀(現代分子生物學(xué)實(shí)驗技術(shù)錄象里的那種)很適合用100ml小燒杯,裝60ml裂解液,這樣能讓超聲頭離液面不高不低,不會(huì )冒泡泡,也不會(huì )灑出來(lái).菌多我就延長(cháng)超聲時(shí)間.

沉淀,也就是包涵體沉淀了,如果要上柱純化,一定要先用4M尿素洗滌一下再用8M尿素溶解.如果不上柱,只是跑跑電泳,可以直接用8M尿素溶解以后,離心取上清,加入適量體積的loading buffer.loading buffer對于包涵體的溶解能力是較弱的.

"取200微升菌液，離心后直接加上樣buffer，100度3分鐘后上樣，然后SDSPAGE. 這個(gè)方法到底能不能溶解細菌中的包涵體? "

而樓主的問(wèn)題,雖然loading buffer對于包涵體的溶解能力是較弱的,但是我覺(jué)得你的做法只是在鑒定有無(wú)表達,用loading buffer是沒(méi)有問(wèn)題的.

2、表達重組蛋白時(shí)，細菌裂解方法都有哪些？

在表達重組蛋白時(shí)，誘導以后跑SDS-PAGE發(fā)現表達都很好，但是在裂解細胞時(shí)遇到問(wèn)題�？偸遣荒軓氐琢呀饧毎�。

首先我采用超聲裂解，可是不管我如何超聲總有部分細菌沒(méi)有裂解。

我的超聲條件如下：寧波新芝超聲細胞破碎儀，功率400W，超5秒，間隔5秒，重復99次。然后顯微鏡觀(guān)察，不徹底時(shí)再重復99次。菌體來(lái)自200 ml培養液，用20 ml PBS重懸。

然后我又嘗試加溶菌酶，首先加至終濃度100 ug/ml，4C半小時(shí)菌液不變粘，加大濃度至1 mg/ml，半小時(shí)后仍無(wú)明顯變化。因為我用的PBS是pH7.4，我懷疑是pH不合適，換用pH8.0 TE buffer，1 mg/ml溶菌酶，4C半小時(shí)仍無(wú)明顯變粘。因為這次使用的溶菌酶是前一天配好的，擔心溶菌酶失效，重新稱(chēng)取凍干粉末，直接加入菌液，仍然沒(méi)有明顯變化。

真是郁悶。到底出了什么事？請高手解答，并介紹優(yōu)化的方案。

同時(shí)希望能介紹一下如何選擇細胞破碎方法，以及如何確定最佳條件。

溶菌酶在pH7.4時(shí)是否沒(méi)有活性了？可否配成濃縮液保存溶菌酶，如果可以，應如何保存？

加入溶菌酶以后，如果細胞壁已破壞，菌液應該變粘吧，因為核酸被釋放出來(lái)。

而超聲破碎細胞，我覺(jué)得菌液是不會(huì )變粘的，因為超聲可以把大分子核酸打碎成小片段。

我判斷細胞破碎不完全是因為，在將破碎后樣品離心分離上清和沉淀跑SDS-PAGE觀(guān)察，發(fā)現在細胞碎片組分中除了經(jīng)常出現的一兩條帶以外，還有菌體總蛋白樣品中的很多帶出現。據此可以判斷細胞只是部分破碎。

不知我的分析是否正確，請版主和各位高手指教。

如果溶菌酶效果還可以，我覺(jué)得先用溶菌酶初步裂解細胞，然后再用超聲進(jìn)一步破碎并斷裂大分子核酸以降低粘度的細胞破碎策略可能比較好。因為超聲有可能使蛋白變性，但單用溶菌酶不能確定是否完全破碎，還要再加核酸酶降低粘度。這種兩步法策略應該還可以減少破碎條件優(yōu)化的時(shí)間。

我用的溶菌酶放置時(shí)間比較長(cháng)了，有可能失活了。我剛從生工又定了一支，不過(guò)得后天到貨，但愿它有用。

如何觀(guān)察溶菌酶是否已裂解細胞，通過(guò)觀(guān)察粘度變化是否可以？

只反復凍融是否可以有效裂解大腸桿菌細胞？

溶菌酶只有在pH值大于8.0的條件下才能發(fā)揮溶菌作用，請務(wù)必保持PBS的pH＞8.0，同時(shí)溶菌酶的量一定要足！

在加入溶菌酶后，最好放于磁力攪拌器上攪拌30分鐘，再進(jìn)行超聲破菌，我的超聲條件是：功率400W，工作2秒，間隔2秒，重復199次。菌體來(lái)自500 ml培養物，用30 ml PBS重懸，超聲效率還是可以的。

哪兒的溶菌酶好用？

我用生工的溶菌酶，稱(chēng)取干粉20mg。200ml菌液用18 ml NaCl重懸，加入2 ml 25mM Tris-HCl(pH8.0)，將溶菌酶干粉加入體系，混勻，測pH降低到5－6，加20 ul 2M Tris堿，體系pH升到～8。4C放置1小時(shí)，菌液上層變澄清，搖動(dòng)發(fā)現體系沒(méi)有變粘。測pH仍在8左右。再37C保溫1小時(shí)，還沒(méi)有變化，我簡(jiǎn)直不知如何才好了。

另一瓶200ml培養物，溶菌酶處理1小時(shí)后超聲。條件：300W，超5秒停5秒，重復99次。菌液有變化，但很不明顯。繼續超聲400次，從外觀(guān)來(lái)看沒(méi)有太大區別。我簡(jiǎn)直要說(shuō)tmd了。見(jiàn)鬼了。

我的操作有什么地方不妥當，請各位指正。

溶菌酶的廠(chǎng)商要求是否很重要？

我的誘導物來(lái)自1：20過(guò)夜培養物接種，37C生長(cháng)3小時(shí)后30C誘導2小時(shí)（0.8mM IPTG）。

是否菌液太濃，Pharmacia的說(shuō)明書(shū)200 ml培養物用10 ml重懸，我用20 ml，仍然不夠��？有人告訴我菌液應該稀一些，200 ml用30－40 ml重懸。但實(shí)際操作也不夠理想。

SDS-PAGE總是觀(guān)察到細胞破碎效果不夠徹底。超聲那么多次，蛋白都要被超碎變性了。

3、酵母的破碎

酵母是一類(lèi)單細胞真菌的總稱(chēng)，其成員分別屬于不同的真菌綱，細胞壁成分是否會(huì )有較大差別，這些都是做破碎酵母細胞前要考慮的。我歸納了一下，做破碎酵母的幾種方法：

1 機械的方法：一般的PROTOCOL都是用glass beads：如 sigma G-8772，加玻璃珠后超聲，蛋白活性保持較好。

2 化學(xué)裂解的方法：10g酵母 加1ml的乙酸乙酯，充分攪拌至液體狀（希望高手點(diǎn)評）

3 尿素裂解液（尿素8mol/L, NaCl 0.5mol/L,Tris 20mmol/L, EDTA 20mmol/L, 2%SDS, PH值8.0）高壓勻漿。（這個(gè)好象也該在方法2中）

4 液氮凍融并研磨酵母破壁，我認為這種可能在小試中比較合適。

5 溫和的酶法，可能不會(huì )會(huì )破壞酵母原生質(zhì)體

酶法裂解主要用兩種酶：1。蝸牛酶，可以直接從蝸牛的胃液中獲得；2。lyticase，可以從sigma定購。這兩種酶解法都可以和上面的幾種方法結合使用，尤其是glass beads方法，效果很好。

我用過(guò)化學(xué)裂解的方法，10g酵母 加1ml的乙酸乙酯，充分攪拌至液體狀。此法的裂解效果不錯的，不妨試一下。

一篇文章是加尿素裂解液（尿素8mol/L, NaCl 0.5mol/L,Tris 20mmol/L, EDTA 20mmol/L, 2%SDS, PH值8.0），據說(shuō)效果可以

酵母破碎效果好的我所做過(guò)的方法中還是玻璃珠，就象microbe 和rongjunli所說(shuō)的那樣，效率很高的，而且對目的蛋白活性不會(huì )有什么影響。一般應該用這個(gè)方法。

4、超聲破碎的條件選擇

超聲破碎的條件不能一概而論，要看你的實(shí)驗要求，有的是細菌破碎，有的是對組織細胞進(jìn)行破碎，要掌握好功率和每次超聲時(shí)間，功率大時(shí)，每次超聲時(shí)間可縮短，不能讓溫度升高，必要時(shí)在冰浴條件下進(jìn)行超聲破碎。至于每次超聲時(shí)是否起泡沫到不是關(guān)鍵的問(wèn)題，這與你超聲的量明顯有關(guān)。

5、如何鑒定細菌超聲破碎的程度

最簡(jiǎn)單的方法：涂片--革蘭氏結晶紫溶液染色0.5分鐘---顯微鏡觀(guān)察

切記：只用結晶紫染色，別忘了染色后再用水稍沖洗一下

6、細菌裂解的DNaseI

不同純度的酶換算標準不同，所以你最好查查是哪個(gè)公司的酶？仔細看說(shuō)明書(shū)，可能會(huì )有換算說(shuō)明。

另外看一下參考文獻所用的酶是哪個(gè)公司的，到該公司的主頁(yè)也可能有收獲。

我用過(guò)華美和TAKARA的DNA酶，華美的是用mg/ml。華美也有RNase free的DNA酶，定量用活性單位。TAKARA的兩種酶都是用活性單位定量的。

我在超聲裂解細菌時(shí)加入一些DNA酶，一般用超聲液加不同量的酶做一個(gè)預實(shí)驗，選取符合你需要的酶量。

其實(shí)根據目的和方法的不同，所需要的酶量也是可調節的，比如酶切溫度（16度或37度）。

7、超聲裂解細菌是否完全？

最簡(jiǎn)單的方法：涂片--革蘭氏結晶紫溶液染色0.5分鐘---顯微鏡觀(guān)察

切記：只用結晶紫染色

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