植物病毒病檢測方法（三）

1.4.3 電子顯微鏡計數

本世紀三十年代初電子顯微鏡的發(fā)明，使我們能夠觀(guān)察到病毒的分子及其細微結構。1940年Kausche和Melcher首次在電子顯微鏡下觀(guān)察到煙草花葉病毒的顆粒。電鏡技術(shù)的建立對病毒學(xué)的發(fā)展起了巨大的推動(dòng)作用。

在實(shí)際生產(chǎn)過(guò)程中，根據病毒的種類(lèi)與特點(diǎn)的不同，往往需要把幾種方法結合起來(lái)，就可望建立一套快速、靈敏、準確、高效的水體植物病毒的檢測方法。

1.4.4.分子生物學(xué)法

分子生物學(xué)檢測法能夠檢測病毒的侵染能力。此方法靈敏度最高，能檢測到pg級甚至fg級[1ｆｇ(飛克)=1×10-15ｇ]的病毒,特異性強，檢測速度快，操作簡(jiǎn)便，可用于大量樣品的檢測(侯義龍,2000)。目前,常用的分子生物學(xué)方法有核酸分子雜交技術(shù)、dsRNA電泳技術(shù)、多聚酶鏈式反應技術(shù)等。侯義龍.果樹(shù)主要病毒RT-PCR檢測體系的建立、優(yōu)化及病毒特異DNA片段克隆測序研究.[博士學(xué)位論文].沈陽(yáng):沈陽(yáng)農業(yè)大學(xué),2000.6

核酸分子雜交技術(shù) 具有一定同源性的2條核酸單鏈在一定的條件下(適宜的溫度及離子強度等)可按堿基互補原則退火形成雙鏈。此雜交過(guò)程是高度特異性的。雜交的雙方是使用的探針和要檢測—的核酸。待測核酸可以是克隆的基因片段,也可以是未克隆化的基因組DNA和細胞總RNA。根據使用的方法,被檢測核酸可以是提純的(膜上印跡雜交或液相雜交),也可以在細胞內雜交(細胞原位雜交) (盧圣棟，1999)。

雙鏈RNA(dsDNA)電泳技術(shù) ssRNA病毒在植物體內增殖,通過(guò)核酸互補而形成一種健康植物沒(méi)有的堿基配對dsRNA。DsRNA經(jīng)提純、電泳、染色后,在凝膠上所顯示的譜帶可以反映每種病毒組群的特異性,并且有些單個(gè)病毒的dsRNA在電泳圖譜上也顯示一定的特征。因此,利用病毒dsRNA的電泳圖譜可以檢測出病毒的類(lèi)型和種類(lèi)（董穎蘋(píng),2001；李鵬翔，2000）。此法已用于一些病毒組(如黃化病毒組、馬鈴薯Y病毒組、番石竹潛病毒組、煙草壞死病毒組、黃瓜花葉病毒組、絨毛煙斑駁病毒組)的分類(lèi)研究。

多聚酶鏈式反應(polymerasechainreaction,PCR)技術(shù) 是一種在體外快速擴增特定基因或DNA序列的方法，是近10年來(lái)發(fā)展和普及最迅速的分子生物學(xué)新技術(shù)之一(吳乃虎，2000；)。由于它具有強大的擴增能力,并且可與其它分子生物學(xué)方法(如核酸雜交)和免疫學(xué)方法(如ELISA)相結合應用,使其敏感性和特異性都大大增強；因而廣泛地應用于生物醫學(xué)領(lǐng)域的各個(gè)學(xué)科（梁國棟，2001）。靈敏度最高, 儀器價(jià)格昂貴，試驗技術(shù)要求高。

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