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（一）細菌的分離培養
1．培養基制作的原則和一般步驟
（1）培養基制作的原則 培養基是人工方法將多種物質(zhì)按照各類(lèi)微生物生長(cháng) 的需要而合成的一種混合營(yíng)養料，一般用以分離和培養菌類(lèi)。常用的培養基有基礎培養基、增菌培養基、選擇培養基、鑒別培養基等。在制作培養基時(shí)應掌握如下原則和要求：
①培養基必須含有細菌生長(cháng)所需要的營(yíng)養物質(zhì)。
②必須徹底滅菌,不得含有任何活細菌。
③培養基的材料和盛培養基的容器上,沒(méi)有抑制細菌生長(cháng)的物質(zhì)。
④所制備培養基應該是透明的，以便觀(guān)察細菌生長(cháng)性狀和其它代謝活動(dòng)所產(chǎn)生的變化。
⑤培養基的酸堿度應該符合細菌的生長(cháng)要求，多數細菌生長(cháng)適宜范圍是弱堿（pH7.1~7.6）。
（2）培養基制備的一般過(guò)程 不同的培養基其制備方法不同，一般要經(jīng)如下步驟：
①根據不同的菌類(lèi)和用途，選擇適宜的培養基。
②精確稱(chēng)量各種成分。
③將各種成分按規定加熱溶解，調整pH到適宜的范圍內。再加熱煮沸10~15分鐘（注意補加液體的損耗）
④過(guò)濾（用濾袋或紗布棉花），分裝、滅菌（不同的培養基的滅菌溫度和時(shí)間不同，通常為
⑤培養基中的某些成分，象血清、腹水、糖類(lèi)、尿素、氨基酸、酶等，在高溫下易分解，變性，故應用濾菌器過(guò)濾，再按規定的溫度和量加入培養基中。
⑥無(wú)菌檢驗，取作好的培養基數管，置
2．細菌的分離培養
在細菌學(xué)診斷中，細菌的分離培養是不可缺少的一環(huán)，分離培養的目的是在病料中由多種細菌里挑選出可疑菌。在分離培養之前，首先應該注意下列事項：
（1）選擇適合于所含分離細菌生長(cháng)的培養基。
（2）培養溫度一般在
（3）考慮所分離的細菌是需氧性或厭氧性，進(jìn)一步?jīng)Q定培養條件。
（4）初步分離時(shí)發(fā)現有多種細菌，應進(jìn)一步選擇可疑菌落進(jìn)行純培養
（二） 細菌的接種
1．平板劃線(xiàn)法 此法為常用的細菌分離培養法。平板劃線(xiàn)培養的方法甚多，可按各人的習慣選擇應用，其目的都是將被檢材料作適當的稀釋?zhuān)郧螳@得獨立單在的菌落，防止發(fā)育成菌苔，以致不易鑒別其菌落性狀。劃線(xiàn)培養時(shí)須注意以下幾點(diǎn)：
（1）左手持皿，用左手拇指，食指及中指將皿蓋揭開(kāi)成20度左右的角度（角度愈小愈好，以免空氣中的細菌進(jìn)入皿中將培養基污染）。
（2）右手持接種環(huán)，將材料少許涂布于培養基邊緣，然后將接種環(huán)上多余的材料在火焰中燒毀，待接種環(huán)冷卻后，再與涂材料之處輕輕接觸，開(kāi)始劃線(xiàn)。
（3）劃線(xiàn)時(shí)先將接種環(huán)稍稍彎曲，這易和平皿內瓊脂平行，不致劃破培養基。
（4）劃線(xiàn)中不宜過(guò)多地重復舊線(xiàn)，以免形成菌苔。
（5）平皿蓋向下，在培養皿上標注樣品名稱(chēng)、編號、接種日期后，置溫箱中培養。
2．斜面接種法
3．液體培養基接種法
（三）細菌培養性狀觀(guān)察
1．細菌在液體培養基中生長(cháng)性狀觀(guān)察
（1）渾濁度 觀(guān)察是否透明，輕度渾濁，中度渾濁或極度渾濁，還有均勻渾濁，顆粒狀渾濁，絮狀渾濁。
（2）沉淀 試管底有無(wú)沉淀，沉淀物呈顆粒狀，粘稠狀或絮狀。輕搖時(shí)云霧狀，絮狀或發(fā)辮狀開(kāi)起。
（3）表面 有無(wú)菌膜及附著(zhù)于管壁的菌環(huán)。
（4）色素及氣味
2．細菌在固體培養基上菌落生長(cháng)性狀觀(guān)察
（1）大小 各種細菌菌落大小差異很大，菌落直徑在1毫米以下為露滴狀菌落；1~2毫米為小菌落；2~4毫米為中等大菌落；4~6毫米或更大為大菌落。
（2）形狀 有圓形、規則形、根足形、菌絲狀等。
（3）邊緣 有整齊、鋸齒狀、纖毛狀、卷發(fā)狀等。
（4）表面 有光滑、濕滑、粗糙、顆粒狀、皺絲狀、同心狀、放射狀等。
（5）降起度 有角平、隆起、臍狀、扭扣狀。
（6）顏色 有無(wú)色、白色、灰白色、金黃色、檸檬色、綠色、紅色等。
（7）透明度 有透明、半透明、不透明等。
（四）顯微鏡檢查——細菌抹片制備、染色及鏡檢
細菌細胞微小，無(wú)色而半透明，原樣直接在普通光學(xué)顯微鏡下觀(guān)察，只能大致見(jiàn)到其外貌，制成抹片和染色之后，則能較清楚地顯示其形態(tài)和特殊構造，也可以根據不同的染色反應，作為鑒別細菌的一種依據。
常應用各種染料對細菌進(jìn)行染色，由于毛細管、滲透、吸附和吸收等物理作用，以及離子交換，酸堿等化學(xué)作用，染料就能使細菌著(zhù)色，且因細菌細胞的結構和化學(xué)成分不同，而含有不同的染色反應。
1．細菌抹片的制備
進(jìn)行細菌染色之前，須先作好細菌抹片，其方法如下：
（1）玻片準備 載玻片應清晰透明、潔凈而無(wú)油漬，滴上水后，能均勻展開(kāi)，附著(zhù)性好。如有油漬，可按下列方法處理：
①滴上95%酒精2~3滴，用潔凈紗布揩擦，然后在酒精燈火焰上輕輕拖過(guò)幾次。
②若上法仍未能去除油漬，可再滴上1~2滴冰醋酸，用紗布擦凈，再在酒精燈火焰上輕輕通過(guò)。
（2）抹片 所用材料情況不同，抹片方法亦有差異。
液體材料（如液體培養物、血液、滲出液、乳汁等）可直接用滅菌接種環(huán)取一環(huán)材料，于玻片的中央均勻地涂布成適當大小的薄層。
不是液體材料（如菌落、膿、糞便等）則應先用滅菌接種環(huán)取少量生理鹽水或蒸餾水，置于玻片中央，然后再用滅菌接種環(huán)取少量材料，在液滴中混合，均勻涂布成適當大小的薄層。
組織臟器材料，先用鑷子夾持局部，然后以滅菌或潔凈剪刀取一小塊，夾出后將其新鮮切面在玻片上壓積或涂抹成一薄片。
如有多個(gè)樣品同時(shí)需要制成抹片，只要染色方法相同，亦可以在同一張玻片上有秩序地排好，作多點(diǎn)涂抹，或者先用蠟筆在玻片上劃分成若干小方格，每方格涂抹一種樣品，需要保留標本片，應貼標簽，注明菌名、材料、染色方法和制片日期等。
（3）干燥 上述涂片，應讓其自然干燥。
（4）固定 有兩類(lèi)固定方法。
① 火焰固定 將干燥好的抹片，使涂抹面向上，以其背面在酒精燈火焰上來(lái)回通過(guò)數次，略作加熱（但不能太熱，以不燙手背為度）進(jìn)行固定。
② 化學(xué)固定 血液、組織臟器等抹片要作姬姆薩（Giemsa）染色，不用火焰固定，而應用甲醇固定，可將已干燥的抹片浸入甲醇中2~3 分鐘，取出晾干；或者在抹片上滴加數滴甲醇使其作用2~3分鐘后，自然揮發(fā)干燥。抹片如作瑞特氏染色（Wright’s stain），則必先須作特別固定，染料中含有甲醇，可以達到固定的目的。
將抹片固定的目的有如下幾種：
①除去抹片的水分，涂抹材料能很好地貼附玻片，以免水洗時(shí)易被沖掉
②使抹片易于著(zhù)色或更好地著(zhù)色，因為死的蛋白質(zhì)比活的蛋白質(zhì)著(zhù)色力較強。
③可能殺死抹片中的微生物。
必須注意：在抹片固定過(guò)程中，實(shí)際上并不能保證殺死全部細菌，也不能完全避免在染色水洗時(shí)不將部分抹片沖脫。因此，在制備烈性病原菌，特別是帶芽孢的病原菌的染色抹片時(shí)，應嚴格慎重處理染色用過(guò)殘液和抹片本身，以免引起病原的散播。
固定好的抹片，即可進(jìn)行各種方法的染色。
2．幾種常用染色方法
常用的細菌染色方法，主要有兩種類(lèi)型：
（1）簡(jiǎn)單染色法 只應用一種染料進(jìn)行染色的方法，如美藍染色法。
（2）復染色法 應用兩種或兩種以上的染料或再加媒染劑進(jìn)行染色的方法。染色時(shí)，有些是將染料分別先后使用，有些則同時(shí)混合使用。染色后不同的細菌和物體，或者細菌構造的不同部分可以呈現不同的顏色，有鑒別細菌的作用，又可稱(chēng)為鑒別染色，如革蘭氏染色法、抗酸性染色法、瑞特氏染色法和姬姆薩染色法。
①美藍染色法 在已干燥、固定好的抹片上，滴加適量的（足夠覆蓋涂抹點(diǎn)即可）美藍染色液，經(jīng)1~3分鐘，水洗，干燥（可用吸水紙吸干，或自然干燥，但不能烤干），鏡檢。
②革蘭氏染色法
A．在已干燥、固定好的抹片上，滴加草酸銨結晶紫染色液，經(jīng)1~2 分鐘，水洗。
B．加革蘭氏碘溶液于抹片上媒染，作用1~2 分鐘，水洗。
C．加95%酒精于抹片上脫色，約0.5~1 分鐘，水洗。
D．加稀釋石炭酸復紅（或沙黃水溶液）復染10~30秒，水洗。
E．吸干或自然干燥，鏡檢。革蘭氏陽(yáng)性菌呈藍紫色，革蘭氏陰性菌呈紅色。
③ 抗酸染色法
A．萋一尼（Ziehl-Neelsen）氏抗酸染色法 首先在已干燥、固定好的抹片上，滴加較多量的石炭酸復紅染色液，在玻片下以酒精燈火焰微微加熱至發(fā)生蒸氣為度（不要煮沸），維持微微發(fā)生蒸氣，經(jīng)3~5分鐘，水洗。然后用3%鹽酸酒精脫色，至標本紅色脫出為止，充分水洗。再用堿性美蘭染色液復染約1分鐘，水洗。最后吸干，鏡檢�？顾嵝约毦始t色，非抗酸細菌呈藍色。
B．又法之一：將固定后的抹片滴加金（Kinyoun）氏石炭酸復紅液，歷3 分鐘。此液配法為：
堿性復紅
石炭酸（化學(xué)純） 9毫升 蒸餾水 100毫升
溶堿性復紅于酒精，再緩緩加水并搖振，再加入石炭酸混合。
連續水洗1.5分鐘后滴加加鮑脫（Gabbott）氏復染液歷1分鐘。此液配法為：
美藍
濃硫酸 20毫升 蒸餾水 50毫升
先將美藍溶于乙醇，再加蒸餾水，再加硫酸。
連續水洗1 分鐘，吸干，鏡檢�？顾峋始t色，其他菌呈藍色。
C.又法之二：滴加石炭酸復紅液于抹片（已干燥固定過(guò)的）上染1 分鐘；水洗；再用1%美藍酒精溶液復染20秒；水洗，干燥，鏡檢�？顾峋t色。
鏡檢前對光檢查染色片，標本片務(wù)必全呈藍色。如標本片呈現紅色或棕色，表示復染不足，應再作復染5~10 秒，再觀(guān)察。如仍未全呈藍色時(shí)，仍可反復復染，至符合要求為止。
④ 瑞氏染色法
方法一：抹片自然干燥后，滴加瑞特氏染色液于其上，為了避免很快變干，染色液可稍多加些，或者看情況補充滴加，經(jīng)1~3分鐘，再加約與染液等量的中性蒸餾水或緩沖液，輕輕晃動(dòng)玻片，使與染液混勻，經(jīng)5分鐘左右，直接用水沖洗（不可先將染液傾去），吸干或烘干，鏡檢。細菌染成藍色，組織、細胞等物呈其他顏色。
方法二：抹片自然干燥后，按涂抹點(diǎn)大小，蓋上一塊略大的清潔濾紙片，在其上輕輕滴加染色液，至略浸過(guò)濾紙，并看情況補滴，維持不使變干；染色3~5分鐘鐘，直接以水沖洗，吸干或烘干，鏡檢。此法的染色液經(jīng)濾紙濾過(guò)，可大大避免沉渣粘附抹片上而影響鏡檢觀(guān)察。
⑤ 姬姆薩氏染色法
A.于5毫升新煮過(guò)的中性蒸餾水中滴加5~10滴姬姆薩染色液原液，即稀釋成 常用的姬姆薩染色液。
B.抹片經(jīng)甲醇固定并干燥后，在其上滴加足量染色液或將抹片浸入盛有染色液的染色缸中，染色30分鐘，或者染色數小時(shí)至24小時(shí)，取出水洗，吸干或烘干，鏡檢。細菌呈藍青色，組織、細胞等呈其他顏色，視野常呈紅色。
3.細菌基本形態(tài)及構造的觀(guān)察
（1）細菌的形態(tài)
①球菌：
雙球菌：注意其成雙的排列，兩個(gè)菌體接觸面的形狀以及菌體的形態(tài)。
鏈球菌：注意其鏈狀排列，鏈的長(cháng)短，個(gè)體的形態(tài)。
四聯(lián)球菌：注意其四個(gè)聯(lián)結成方形排列的形態(tài)。
八疊球菌：注意其八個(gè)堆疊一起，呈立體方形的形態(tài)。
葡萄球菌：注意其無(wú)一定次序，無(wú)一定數目，不規則地堆在一起的形態(tài)。
②桿菌：
單桿菌：注意其單個(gè)散在的狀態(tài)，菌體外形、大小、菌端的形狀。
雙桿菌：注意其成雙的排列以及菌體外形、大小、菌端的形狀。
鏈桿菌：注意其成鏈狀排列，鏈的長(cháng)短，菌體外形、大小、菌端的形狀。
③螺旋狀菌：
弧菌：注意其彎曲成弧形以及菌體大小，菌端的形狀。
螺菌：注意其具有兩個(gè)彎曲以上的螺旋狀及菌體的長(cháng)度、大小，菌端的形狀。
（2）細菌的一些構造
①莢膜：注意莢膜的位置、形狀、大小、染色及相互間的聯(lián)結。
②鞭毛：注意鞭毛的形狀、長(cháng)度、大小、數目及其在菌體上的排列（單毛、叢毛、周毛）。
③ 芽孢：注意芽孢的形狀，與菌體相比的大小以及在菌體中的位置（中央、偏端、末端）。
④異染顆粒：注意其與菌體不同的染色反應、形狀、大小、多少、位置等。
（五） 動(dòng)物試驗
為了作細菌或其它微生物的分離鑒定，致病力測定等，常用實(shí)驗動(dòng)物進(jìn)行接種，常用的實(shí)驗動(dòng)物接種方法有下列數種。
1． 皮下接種
（1）家兔皮下接種 由助手把兔伏臥或仰臥保定，于其背側或腹側皮下結締組織疏松部分剪毛消毒，術(shù)者右手持注射器，以左手拇指、指食和中指捏起皮膚使成一個(gè)三角形皺褶，于其底部進(jìn)針，感到針頭可隨意撥動(dòng)即表示插入皮下。當壓入注射物時(shí)感到流利暢通也表示在皮下。拔出注射針頭時(shí)用消毒棉球壓住針孔并稍加按摩。
（2）豚鼠皮下接種 保定和術(shù)式同家兔。
（3）小白鼠皮下注射 作小白鼠皮下注射接種無(wú)須助手幫助保定。術(shù)者在做好接種準備后，以右手捏取鼠尾，此時(shí)鼠頭會(huì )向前掙扎而可以緊牽其尾，然后用左手的拇指和食指捏住其兩耳及其頭頸部皮膚使其翻轉，背部皮膚固定于左手中指、無(wú)名指及拇指基部之間，以小指壓住其尾根，小白鼠即仰臥保定于左手上。右手操作局部消毒，把持注射器，以針頭稍微挑起皮膚插入皮下，注入時(shí)見(jiàn)有水泡微微鼓起即表示注入皮下。拔出針頭后，同家兔皮下注射時(shí)一樣處理。
2．皮內接種 作家兔、豚鼠及小白鼠的皮內接種時(shí)，均需助手保定動(dòng)物，其保定方法與皮下接種相同。接種時(shí)術(shù)者以左手拇指及食指夾起皮膚，右手持注射器，針頭要很細，針頭插入拇指與食指之間的皮膚內，針頭插入不宜過(guò)深，同時(shí)針頭插入角度要小，即與夾起的皮膚平行，注射時(shí)感到有阻力且注射完畢后皮膚上有小硬皰即為注入皮內的表現。皮內接種要慢，否則容易使皮膚脹裂或自針孔流出注射物而散播傳染。
3．腹腔內接種 在家兔、豚鼠及小白鼠的腹腔接種，宜采取仰臥保定。接種時(shí)其后軀應稍抬高使其內臟傾向前腔，接種部位在腹后側面，針頭先插入皮下，后進(jìn)入腹腔，注射后皮膚應無(wú)皰隆起。其余術(shù)式同于皮下接種法。
4．靜脈注射
（1）家兔的靜脈注射 將家兔納入保定器內或由助手保定兔體露出其頭。選一側耳邊緣靜脈，助手以拇指及食指緊壓耳根部，使靜脈努張，術(shù)者剪去靜脈管上皮膚的毛，消毒局部，若需對同一動(dòng)物作多次接種時(shí)，應自接近耳尖初處開(kāi)始刺入接種，以后逐次接近耳根。接種時(shí)術(shù)者左手執兔耳，右手持針（針頭不宜太細），以與靜脈平行方向刺入靜脈，同時(shí)助手放松其緊壓手指，以便血液流通。注射時(shí)無(wú)阻力且有血向前流即表示注入靜脈。緩緩注射，注射完針頭拔出后，用消毒棉球緊壓針孔片刻，以免流血或注射物溢出。
（2）豚鼠靜脈內接種 豚鼠靜脈內接種比較困難，因為豚鼠沒(méi)有裸露明顯的靜脈可尋，若必須作注射時(shí)，使豚鼠伏臥保定，腹面向下，將其后肢剃毛，用70%酒精消毒皮膚，施以全身麻醉，用銳利刀片向后肢內上側向外下方切一長(cháng)約一厘米的切口，使露出皮下靜脈，用最小號針頭（26號），刺入靜脈慢慢注入接種物。接種完畢，皮膚應縫合一兩針。
（3）小白鼠靜脈接種 作小白鼠靜脈內接種時(shí)，選尾側靜脈，體重在15~
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