包涵體的分離

一旦一個(gè)穩定的、重復的發(fā)酵過(guò)程建立起來(lái)，則要考慮提取包涵體的步驟了。包涵體處在細胞質(zhì)內或者細胞的外周質(zhì)，必須破壞細胞膜才能把包涵體釋放出來(lái)。 　　溶液中的包涵體也要同破碎液中溶解的成分和不溶的其它成分如細胞碎片、細胞膜以及核糖體等成分分離開(kāi)來(lái)。 提取的第一步是冷卻發(fā)酵液，利用離心或者錯流過(guò)濾的方法收集細胞，細胞的沉淀利用設定的含有一定濃度的離子強度（0.4-0.6mo1）的緩沖液懸浮。這種緩沖液必須控制pH、離子強度、重金屬的濃度和氧化還原的環(huán)境，在以后的操作步驟中也要考慮這些因素。 　　由于包涵體比細胞可以耐受更大的剪切力，所以可以使用的破碎細胞的方法有很多。對于大腸桿菌，最經(jīng)常使用的方法是高壓勻漿的方法，可以使細胞完全破碎，并且這種方法可以以不同的規模使用，2到5個(gè)循環(huán)可以使細胞完全破碎。酵母細胞由于含有更加有彈力的細胞壁，所以需要的循環(huán)可能更多，或者在容器中加入一些玻璃顆粒。破碎細胞還可以使用物理的方法如超聲，或者化學(xué)的方法如化學(xué)試劑和酶，如溶菌酶和EDTA（乙二胺四乙酸）來(lái)破碎細胞。 　　包涵體可以使用過(guò)濾或者離心的方法，把細胞破碎液中的其它成分除去，這兩種方法利用了包涵體的不同物理特性。由于包涵體和可溶蛋白質(zhì)的體積不同，所以可以使用過(guò)濾的方法，這種方法可以降低操作成本，易于放大。一些實(shí)驗已經(jīng)證明過(guò)濾的方法是分離包涵體的有效的手段，但是這種方法也存在著(zhù)一些缺點(diǎn)：過(guò)濾膜很容易被一些不透過(guò)的成分所堵塞，即使使用錯流過(guò)濾或者使用很高的流速，這種情況都不能避免。并且，由于微孔膜是根據成分的大小來(lái)分離的，一些細胞碎片也容易與包涵體混在一起。 　　而包涵體蛋白質(zhì)的密度比相同體積的細胞碎片的密度大得多，所以使用離心的手段可以把包涵體與細胞的其它成分分離開(kāi)來(lái)。如果細胞碎片沒(méi)有同包涵體分離，在以后的分離手段中必須把膜上的組分分離開(kāi)來(lái)。有時(shí)，有些目標蛋白質(zhì)以溶解的形式存在，可以通過(guò)在細胞破碎以前加入一些非極性的物質(zhì)（如苯酚、甲苯）或者去垢劑，通過(guò)這個(gè)方法可以提高從大腸桿菌表達的人生長(cháng)激素包涵體的收率。

　　連續離心技術(shù)是工業(yè)生產(chǎn)中獲得包涵體最經(jīng)常使用的操作。由于細胞碎片的密度比包涵體小，則沉降的速度比包涵體要小，連續的懸浮、離心可以把大部分的包涵體離心下來(lái)，而細胞碎片逐步除去。SDS-PAGE（十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酞胺凝膠電泳）分析發(fā)現，離心的方法可以達到沉降物中的蛋白質(zhì)的含量大于90%。

     當細胞碎片與包涵體混在一起難于分離時(shí)，可以采用一些化學(xué)的方法把細胞碎片離子交換色譜復性蛋白質(zhì)與包涵體分離開(kāi)，否則溶解包涵體以后，膜蛋白質(zhì)溶在包涵體蛋白質(zhì)的溶液中，會(huì )污染以后的操作。特別如果一些膜蛋白質(zhì)具有蛋白質(zhì)酶的活性，則溶解以后的包涵體蛋白質(zhì)可被降解。如果溶解原核細胞膜蛋白質(zhì)的一些溶劑不能溶解包涵體蛋白質(zhì)時(shí)，可以使用溶解的方法把膜蛋白質(zhì)除去。最經(jīng)常的選擇性溶解膜蛋白質(zhì)的方法是利用鰲合金屬的試劑如EDTA、中性的去垢劑如Triton X-100，或者一些鹽如，脫氧膽酸鹽，或者弱離液劑，如2mol/L的脲。Babbit等人發(fā)現經(jīng)過(guò)前面的步驟，可以提高肌氨酸激酶的復性收率，活性提高的原因是使用弱的去垢劑辛基糖除去了蛋白質(zhì)酶。

　　離心和高壓勻漿都有可能產(chǎn)生泡沫，所以必須在工業(yè)規模中避免這種無(wú)謂的損失。有些工業(yè)生產(chǎn)中，分離以前在發(fā)酵罐中把細胞殺死使細胞內的物質(zhì)釋放出來(lái)，并同時(shí)溶解或者不溶解包涵體蛋白質(zhì)。這種在線(xiàn)殺死細胞的方法己經(jīng)用來(lái)生產(chǎn)兩種蛋白質(zhì)：在堿性條件下溶解類(lèi)胰島素生長(cháng)因子和高溫、酸性條件下生產(chǎn)重組的抗真菌肽段。這種方法的優(yōu)點(diǎn)是可以節省操作時(shí)間以及能量消耗，僅僅需要一步離心的步驟。最經(jīng)常使用的殺死細胞的試劑有苯乙醇，辛酸，氯仿，甲苯等。殺死細胞時(shí)也有缺點(diǎn)，溶解的目標蛋白質(zhì)中含有蛋白質(zhì)或者非蛋白質(zhì)的物質(zhì)，降低了蛋白質(zhì)的純度；如果目標蛋白質(zhì)沒(méi)有被溶解，則殺死細胞會(huì )使可溶蛋白質(zhì)產(chǎn)生沉淀，使得包涵體的純化比較困難，或者破壞包涵體內部的重組蛋白質(zhì)。

 

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