包涵體的形成

主要因為在重組蛋白的表達過(guò)程中缺乏某些蛋白質(zhì)折疊的輔助因子或環(huán)境不適，無(wú)法形成正確的次級鍵等原因形成的。

　　1、表達量過(guò)高，研究發(fā)現在低表達時(shí)很少形成包涵體，表達量越高越容易形成包涵體。原因可能是合成速度太快，以至于沒(méi)有足夠的時(shí)間進(jìn)行折疊，二硫鍵不能正確的配對，過(guò)多的蛋白間的非特異性結合，蛋白質(zhì)無(wú)法達到足夠的溶解度等。

　　2、重組蛋白的氨基酸組成：一般說(shuō)含硫氨基酸越多越易形成包涵體，而脯氨酸的含量明顯與包涵體的形成呈正相關(guān)。

　　3、重組蛋白所處的環(huán)境：發(fā)酵溫度高或胞內pH接近蛋白的等電點(diǎn)時(shí)容易形成包涵體。

　　4、重組蛋白是大腸桿菌的異源蛋白，由于缺乏真核生物中翻譯后修飾所需酶類(lèi)，致使中間體大量積累，容易形成包涵體沉淀。因此有人采用共表達分子伴侶的方法以增加可溶蛋白的比例。

　　在基因重組技術(shù)得到迅速發(fā)展之前，研究者就已經(jīng)發(fā)現，細胞內人工引入反常的蛋白質(zhì)（這些蛋白質(zhì)可以看作是細胞的外源蛋白質(zhì)），這些蛋白質(zhì)會(huì )堆積起來(lái)形成不溶的形式。這些蛋白質(zhì)聚集的形態(tài)是明顯的球形，這些球形的物質(zhì)全部是蛋白質(zhì)，并且通過(guò)非共價(jià)鍵的作用力形成，必須使用變性劑如十二烷基硫酸鈉（SDS）或者鹽酸胍才能溶解。自從基因工程的蛋白質(zhì)在大腸桿菌表達以后，人們逐漸發(fā)現這些外源蛋白質(zhì)基因在細胞中的過(guò)量表達同樣形成不溶性的狀態(tài)。

　　Georgiou等人發(fā)現天然的蛋白質(zhì)在大腸桿菌中大量表達時(shí)，如內酰氨酶和堿性磷酸酶的過(guò)量表達，都形成了包涵體，前者的包涵體在外周質(zhì)，后者的包涵體存在于細胞質(zhì)中。其它的宿主細胞中也發(fā)現了重組蛋白質(zhì)過(guò)量表達時(shí)形成的包涵體或者聚集體，如細菌病毒、哺乳動(dòng)物細胞中。

　　包涵體在一些外界壓力下也可以形成，如溫度，是影響包涵體形成與否的主要因素。有些蛋白質(zhì)在高溫的情況下容易形成包涵體，這是由于這些蛋白質(zhì)在高溫下容易變性而形成聚集體。所以有人認為，當蛋白質(zhì)具有高的融化溫度、高的天然構象穩定性的情況下，包涵體就不容易形成。但是，對一些體內包涵體形成的研究發(fā)現，包涵體的形成先于成熟肽鏈的形成，或者是同時(shí)進(jìn)行的。在研究P22尾刺蛋白質(zhì)發(fā)現，盡管尾刺蛋白質(zhì)有高的穩定性，結構中主要是片斷，融化的溫度是88℃，并不受SDS、蛋白質(zhì)酶和熱失活的作用，但是這種蛋白質(zhì)是為數不多的在細胞內形成包涵體的原核蛋白質(zhì)模型。有些天然的蛋白質(zhì)在高溫（391℃）表達時(shí)可以提高25%，但是這些蛋白質(zhì)不能折疊成天然的狀態(tài)而形成聚集體。聚集體形成的動(dòng)力學(xué)表明，這些聚集體是從部分折疊的中間體形成的。實(shí)際上，這些折疊的中間體或者形成天然的狀態(tài)，或者形成聚集體，這個(gè)過(guò)程是溫度依賴(lài)性的，溫度的升高利于聚集體的形成。當蛋白質(zhì)肽鏈在高溫下表達，合成的肽鏈足夠早地轉移到低溫下時(shí)，這些蛋白質(zhì)肽鏈會(huì )重新進(jìn)入折疊的過(guò)程。同時(shí)，當尾刺蛋白質(zhì)在允許的溫度下表達后，再把細胞轉移到高溫下，這些蛋白質(zhì)肽鏈保持活性，證明了一旦蛋白質(zhì)被正確的表達并折疊成正確的構象以后，則細胞內的蛋白質(zhì)的穩定性和溶解性在高溫下不再改變。蛋白質(zhì)在體內折疊的中間體對于溫度因子明顯敏感。

　　沙眼衣原體包涵體最近認為較高的溫度可能增加了蛋白質(zhì)合成的速度、折疊中間體形成聚集體的速度以及疏水相互作用力，表達的蛋白質(zhì)易于以包涵體的形式存在。

　　其它的發(fā)酵條件同樣影響蛋白質(zhì)包涵體的形成，發(fā)酵液中加入蔗糖可以大大降低內酰胺酶包涵體的形成。蔗糖的作用可能是穩定天然蛋白質(zhì)的結構或者防止蛋白質(zhì)折疊中間體的聚集。在體外的內酰胺酶折疊復性的過(guò)程中，同樣發(fā)現復性緩沖液中加入蔗糖可以提高蛋白質(zhì)的復性率。其它促重組蛋白質(zhì)可溶性表達的生長(cháng)添加劑還有乙醇（誘導熱休克蛋白質(zhì)的表達）、低分子量的巰基或二硫化合物（影響細胞周質(zhì)的還原態(tài)，從而影響二硫鍵的形成）和NaCl。也有報道認為在豐富的培養基中有利于活性蛋白質(zhì)的表達，當培養條件不佳時(shí)如供氧不足或pH控制不佳時(shí)易形成包涵體。

　　蛋白質(zhì)的聚集體和包涵體不僅僅存在于重組蛋白質(zhì)的表達中，是一個(gè)廣泛存在的現象。通常認為，蛋白質(zhì)的聚集現象，無(wú)論細胞內還是細胞外，都是中間體不能完成折疊而形成自我聚集現象。包涵體的形成與多肽鏈的序列、表達速度、可用的伴侶分子的量以及生長(cháng)的環(huán)境有關(guān)。