PCR方法檢測病原微生物

錄入時(shí)間:2011-8-11 15:19:12 來(lái)源：生物在線(xiàn)

多聚酶鏈反應(polymerase chain reaction，PCR)是一種模擬天然DNA復制過(guò)程，在體外擴增特異性DNA（或RNA）片段的新技術(shù)。本實(shí)驗是將待檢雙鏈DNA經(jīng)94℃高溫變性成單鏈作模板，然后加入一對人工合成的寡核苷酸引物，引物分別與待擴增DNA片段的兩端互補，經(jīng)55℃低溫退火，引物與模板互補結合。在72℃條件下，結合于模板上的引物在DNA聚合酶的催化下，利用反應體系中的4種dNTP為原料，按堿基互補配對的方式延伸合成兩條新的DNA鏈。經(jīng)過(guò)20-30個(gè)周期后，特異的目的DNA可擴增百萬(wàn)倍以上。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后即可觀(guān)察到特異的擴增條帶。
　　PCR方法操作簡(jiǎn)便，靈敏度高，可檢測出少至0.1pg的目的DNA。目前已廣泛應用于多種病原微生物及寄生蟲(chóng)的檢測。
　　【材料】
　　1．無(wú)菌雙蒸水、石蠟油、溴化乙錠
　　2．10×PCR反應緩沖液
　　3．25mmol dNTP混合液
　　4．引物1，引物2各50pmol／u1
　　5．模板DNA
　　6．5U／ul Taq DNA聚合酶
　　【儀器】
　　1．PCR擴增儀
　　2．電泳儀
　　3．紫外線(xiàn)分析儀
　　【方法】
　　1．在0.5m1EP管中，加入以下成分：
　　10×PCR反應緩沖液 5u1
　　引物1 2ul
　　引物1 2ul
　　模板DNA 10u1
　　dNTP混合液 4ul
　　Taq DNA聚合酶 1ul
　　無(wú)菌雙蒸水加至 50ul
　　混勻, 加50 ul石蠟油，防止樣品水分蒸發(fā)。
　　2．將反應管置于PCR儀中，94℃變性4min。然后按94℃變性30s→55℃退火30s→72℃延伸1min，循環(huán)35次后，72℃延伸10 min。
　　3．反應完成后，取l0ul PCR擴增液，加至2％瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳，電壓100V，電泳30~60min后，置紫外線(xiàn)分析儀下觀(guān)查擴增結果。

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