病毒學(xué)實(shí)驗技術(shù)（5）

細胞的制備

應用細胞種類(lèi)很多，茲以原代豬腎細胞為例。

（一）無(wú)菌取胚胎或仔豬腎。

（二）去腎被膜，切開(kāi)腎為兩半，剪去腎盂及髓質(zhì)部。

（三）以含青霉素各200單位／ml的磷酸鹽緩沖鹽水洗去血球，用剪刀剪成約小米粒大的小塊，移于滅菌三角瓶中。

（四）再用含抗菌素的磷酸鹽緩沖液洗3～4次至洗液徹底清亮為止。

（五）加入3～4倍以上體積的35℃胰酶液，在電磁攪拌器上攪拌消化（如無(wú)電磁攪拌器可置40℃水浴鍋中，內加無(wú)菌玻璃珠搖動(dòng)），攪拌（或搖振）時(shí)以發(fā)生旋渦而不起泡沫為度，至液體明顯混濁時(shí)（約10分鐘左右），再用吸管或注射器吹打數次，待組織塊沉淀后，將上層被消化后的細胞吸出，再加入消化液，將余下組織塊再同樣消化于40℃10～20分鐘，再次吹打，分散細胞，將兩次消化液匯合一起，經(jīng)四層紗布過(guò)濾，收集濾液，離心（1500轉／分，10分鐘），棄上清液，加入含抗菌素的（見(jiàn)前述）漢克斯氏液懸浮，再離心，棄上清，加入營(yíng)養液（見(jiàn)下述）懸浮，再離心。

亦可將組織塊在4℃下消化16～24小時(shí)（所謂冷消化法），攪拌，吹打，收集細胞液，離心，同上述。

（六）末次離心后，棄上液，加入少許營(yíng)養液懸浮，用計算白血球的方法計算每毫升中細胞數，計數發(fā)現細胞太多時(shí)可取少許濃細胞液加營(yíng)養液適當稀釋后再計。

 （七）根據計數結果，以營(yíng)養液稀釋到每毫升含腎細胞100萬(wàn)個(gè)。有經(jīng)驗的工作人員，可以不計數，稀釋細胞到適當的混濁度即可。

營(yíng)養液：取10 ml小牛血清，80ml漢克斯氏液和10 ml  5％乳蛋白水解物配成營(yíng)養液，加雙抗使每ml營(yíng)養液中含青、鏈霉素各200單位。青、鏈霉素事先可配成各20000單位/ml的溶液。

（八）分裝于小玻瓶（小型實(shí)驗室可用空的鏈霉素瓶，洗凈，滅菌）中，鏈霉素瓶裝1ml，并以蠟筆作瓶的上下記號。

平放靜置37℃孵育兩天后，每日檢查，至長(cháng)成單層為度，快則2～3天，慢則6～7天。如液體混濁說(shuō)明有細菌生長(cháng)，并往往變酸或有霉菌生長(cháng)時(shí)，應廢棄。

（九）換液加病毒

長(cháng)成單層后，吸棄營(yíng)養液，加入9ml維持液。維持液中血清含量比營(yíng)養液少一半（抗菌素含量同上）。接種含病毒的材料0.1ml，放回溫箱再培養。

（十）觀(guān)察及收獲病毒  每日檢查一次，凡有霉菌及細菌生長(cháng)者棄之。病毒在其中生長(cháng)，可引起細胞變性，原生質(zhì)出現顆粒狀，核濃縮或裂解，有的還明顯的引起細胞溶解，出現空斑。發(fā)現有細胞變化或空斑時(shí)，即可將液體收集保存，同時(shí)做無(wú)菌檢驗。所收集的液體即繁殖的病毒液。有的病毒在細胞培養上生長(cháng)，但細胞不出現病變，此時(shí)應以其它方法檢查，如回歸動(dòng)物、END法、熒光抗體檢查等等。

瓶上細胞檢查可作為一個(gè)標本保存，即吸去內溶液以后，經(jīng)甲醇固定，姬姆薩液染色，水洗，干燥后保存。

傳代細胞比初代細胞易于操作，在玻璃器皿內更易于適應，其性能（如所用的或可用的培養液、細胞的形態(tài)、細胞生長(cháng)速度、細胞的保存等）是知道的，故較原代細胞常用。獸醫實(shí)驗診斷室最好備有傳代細胞，以便于從事病毒病的微生物學(xué)診斷。

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