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雞胚接種
（一）雞蛋選擇和孵化 選健康無(wú)病雞群的新鮮受精蛋。雞胚對所要接種的病毒應無(wú)免疫力，因為其抗體可由母雞經(jīng)卵黃而傳給胚胎。以來(lái)航雞蛋或其它白殼蛋為好，因為白殼蛋照蛋時(shí)較易于觀(guān)察。孵化時(shí)以孵卵箱較好，培養細菌的溫箱也可以用，但和孵小雞一樣，特別要求溫度、翻蛋和濕度適當相對濕度為60％左右，所用溫度和孵小雞相似，但最低可用36℃，一般37.5℃，高可到38.5℃，每日翻蛋最少3次，開(kāi)始可以將雞蛋橫放，要接種的前兩天立放，氣室向上，接種前兩天特別注意雞胚位置，希望近中央，不要過(guò)分偏在一邊，胚胎偏在一邊易死亡。接種前兩天若發(fā)現過(guò)分偏在一邊，照蛋后將偏在一邊的胚胎朝下放，可以矯正到雞胚趨向中央。
孵化三、四天，可用照蛋燈在暗室觀(guān)察，雞胚發(fā)育處的血管即明顯可見(jiàn)。沒(méi)有雞胚發(fā)育也無(wú)血管的是未受精蛋。有雞胚但雞胚固定一處不動(dòng)且血管消散呈暗紅色者是死胚�；畹碾u胚，血管及其主要分枝均明顯，呈鮮紅色，雞胚可以活動(dòng)。實(shí)驗室接種用的雞胚最小是6日齡，最大是12、13日齡。此時(shí)雞胚構造如圖20-2所示。
（二）接種前準備
1．病毒的接種材料事先應經(jīng)無(wú)菌檢驗，即接種到一管硫羥代乙酸肉湯（或肉湯、熟肉培養基各一管）不生長(cháng)。要達到材料無(wú)菌，可采取以下措施：
（1）所取材料應無(wú)菌，處理（如研磨、離心取上液等）過(guò)程中也無(wú)細菌污染；
（2）如所取材料已污染，可在每ml材料中加青霉素和鏈霉素各達1000～5000單位（常用1000～2000單位），置室溫中1小時(shí)或冰箱中12～24小時(shí)處理�；蚪�(jīng)濾器除菌。
2．照蛋，以鉛筆劃出氣室、胚胎的位置，若要做卵黃囊接種或血管注射，還要劃出相應的部位。
3．用碘酒在接種處的蛋殼上消毒，并在該處開(kāi)孔。
（三）雞胚接種方法 雞胚接種的方法很多，此僅列舉其中較常用的一些方法。同時(shí)，當列舉的接種途徑有幾種技術(shù)時(shí)，也僅選擇其中最廣泛應用的一種。圖20-3
1．卵黃囊（Yolk sac）接種：大型的原生小體性病毒和立克次氏體易在卵黃囊膜內生長(cháng)。雖然許多較小的病毒也可用卵黃囊途徑接種，但這些病毒主要侵害胚胎本身并在胚胎組織內增殖，而不是侵害卵黃囊組織和在其中增殖。
（1）日齡和準備 孵化5～7天的雞胚較為適用，因為此時(shí)的卵黃囊較大。在檢蛋燈上檢蛋，并用鉛筆畫(huà)出氣室的邊緣。氣室部分的蛋殼稱(chēng)為殼帽，待碘酊干后，在天然氣室的正中處用鉆鉆一個(gè)孔。
（2）接種和孵育 應用裝有2.54cm長(cháng)的8號針頭的注射器，將針頭全長(cháng)穿過(guò)殼帽上的孔直向下插（與雞蛋的長(cháng)軸平行），并把接種物注入卵黃囊內。通常接種0.2～0.5ml。隨后用石蠟——凡士林混合物封閉蛋殼孔，并將雞蛋置37℃孵育。
（3）收獲程序 收獲時(shí)將蛋直立于蛋盤(pán)內。用無(wú)菌鑷子打碎蛋殼，并將殼帽除去。將暴露的膜撕去，并用去掉了嘴的滅菌10ml吸管吸取卵黃。如需收獲卵黃囊膜，可將蛋內容物迅速傾于一個(gè)滅菌平皿內。卵黃囊常在操作時(shí)破裂。卵黃囊呈深黃色，易于識別。用無(wú)菌鑷子將卵黃囊與絨毛尿囊膜分開(kāi)，并與胚胎剝離，迅速移置于一個(gè)滅菌平皿內。如欲收獲雞胚胎，可用彎頭牙科探針鉤住胚胎的頸部取出之，并用無(wú)菌剪刀剪去附著(zhù)的膜后移置于滅菌平皿內。
2．尿囊腔（Allantoic carity） 接種流感病毒和新城疫病毒以及引起呼吸道感染的其他多數病毒都易在尿囊壁的內胚層細胞內生長(cháng)，并釋出于尿囊液中。腦脊髓炎病毒和流行性腮腺炎病毒在用這個(gè)途徑接種時(shí)也易增殖。
（1）日齡和準備 取孵化8～11天的雞胚，檢蛋，并用鉛筆畫(huà)出氣室邊緣。將蛋直立，氣室向上。在雞蛋的側面離氣室底上方幾毫米、絨毛尿囊膜發(fā)育良好處選好一點(diǎn)。用碘酊消毒該點(diǎn)及其周?chē)糠�，在蛋殼上用鉆鉆一個(gè)孔或用針穿刺一個(gè)孔。
（2）接種和孵育 取一長(cháng)1.3cm的7號針頭，接在吸有接種物的小注射器上，通過(guò)蛋殼上的鉆孔，與雞蛋長(cháng)軸平行地或者呈一定角度地將針插入尿囊腔內。每個(gè)蛋注射0.2～0.5ml的接種物。隨后用熱的石蠟—凡士林混合物封閉蛋殼上的鉆孔。將蛋置37℃孵育。
（3）尿囊液的收獲 為使收獲時(shí)不致因出血而有血液流到尿囊液內，可在收獲前將雞胚置冰箱內冷藏4～6小時(shí)。將雞胚直立放置并用無(wú)菌鑷子除去氣室上的蛋殼、暴露氣室底。氣室底由敷覆在絨毛尿囊膜上的內殼膜構成。用一把彎頭小剪將這些膜撕去。為了便于采集尿囊液，可置入一把鑷子，使其尖端朝向蛋殼，將胚胎擠向一側。此時(shí)即可應用5或10 ml滅菌吸管吸取尿囊液。
3．絨毛尿囊膜（Chorioallantoic membrane）接種
（1）日齡和準備 取9～11日齡的雞胚，檢蛋，并用鉛筆在血管最豐富處的蛋殼上畫(huà)出一個(gè)lcm2的區域,應用5％石炭酸消毒蛋殼，待其干燥。不用碘酊消毒，因為酒精溶液可經(jīng)蛋殼吸收，并在絨毛尿囊膜上產(chǎn)生病變，可能被誤認為是由病毒引起的。用鉆子沿蛋殼上的鉛筆線(xiàn)鉆開(kāi)。必須十分小心，切勿弄破內殼膜。隨后在天然氣室上，象上述卵黃囊接種法那樣的鉆孔或刺孔。將蛋平放，使鉆開(kāi)一小塊蛋殼的一側向上。用尖頭鑷子或牙科探針輕輕地將已鉆開(kāi)的蛋殼取去。此時(shí)暴露出內殼膜，它的下面就是絨毛尿囊膜。滴上一滴無(wú)菌生理鹽水，使內殼膜軟化。取一長(cháng)約0.64cm的7號針頭連接于l個(gè)lml注射器上，使針頭尖的斜面以45°角接觸這個(gè)已軟化的內殼膜部分，稍稍向下一壓，即可因牽引而在內殼膜上造成一個(gè)裂縫。必須注意不要損傷下層的絨毛尿囊膜。因為內殼膜的纖維斜向行走，所以應使注射器與雞卵長(cháng)軸呈45°角，這樣向下一壓，就可將纖維分離而不撕斷。隨后用橡皮球在天然氣室的鉆孔上吸氣。也可以在吸氣前先在裂縫上滴加一滴滅菌鹽水。吸入的鹽水可以幫助絨毛尿囊膜與內殼膜分開(kāi)。當部分雞蛋內容物向原來(lái)的天然氣室部分轉移時(shí)，絨毛尿囊膜即塌落。絨毛尿囊膜與內殼膜分離和絨毛尿囊膜塌落的證據，就是內殼膜變?yōu)橥该鳌?/SPAN>
（2）接種和孵育 用一支連接7或8號針頭的1ml注射器，小心地將針頭經(jīng)內殼膜的裂縫插入，滴加0.1～0.2ml接種物于絨毛尿囊膜上。嚴格的操作應在檢蛋燈上進(jìn)行，以保證接種物確實(shí)滴在絨毛尿囊膜上，而不是穿透了絨毛尿囊膜。接種后，將雞蛋稍行搖動(dòng)，使接種物均勻擴散于絨毛尿囊膜表面。蛋殼的開(kāi)口用一小塊橡皮膏封閉。繼續孵育，使蛋殼窗向上。
另一個(gè)接種方法可以不開(kāi)蛋殼窗，方法如下：在已消毒的蛋殼上選好部位鉆孔，達內殼膜。用一6號針頭，使針頭尖的斜面向下，在鉆孔的周?chē)⌒牡厣陨韵聣横橆^，將內殼膜與蛋殼分開(kāi)。隨后將蛋放在檢蛋燈上，并在已經(jīng)鉆好的氣室孔上吸氣。當時(shí)即可清楚地見(jiàn)到絨毛尿囊膜的塌落。
（3）膜組織的收獲 將蛋平放，蛋殼窗向上。用碘酊棉球消毒蛋殼窗周?chē)�，撕去橡皮膏。用滅菌鑷子除去周�(chē)皻�，暴露出絨毛尿囊膜。用鑷子將膜夾住，并用剪刀剪下后迅速移置于一個(gè)滅菌平皿內。
因為9或10日齡的雞胚的絨毛尿囊膜牢固地粘連于內殼膜上，所以一個(gè)通用的方法是在雞胚7、8日齡時(shí)就使絨毛尿囊膜塌落，隨后繼續孵育，直至準備接種時(shí)為止。接種操作需在檢蛋燈上進(jìn)行，以保證此時(shí)絨毛尿囊膜不上升，而且接種物確實(shí)是放在絨毛尿囊膜上而不是在尿囊腔內。隨后用石蠟—凡士林混合物或橡皮膏封閉蛋殼孔。此后按第一法所述方法進(jìn)行孵育和收獲。
4．羊膜（Amniotie）接種 此法主要用于由咽喉洗嗽液中分離流感病毒。由于雞胚在發(fā)育過(guò)程中吞咽羊水，并將其中所含的病毒攜帶至呼吸道和腸道組織，病毒主要在這些組織內增殖。腦脊髓炎病毒也可通過(guò)羊水腔途徑進(jìn)行分離。
（1）日齡和準備 用7～15日齡的雞胚，檢蛋，確定胚胎位置，隨后根據胚胎位置在雞蛋的側面、氣室上方蛋殼的相應位置上選點(diǎn)并標記。按常法處理后，象卵黃囊接種那樣鉆孔。
（2）接種和孵育 接種時(shí)應用lm1注射器，連接一個(gè)長(cháng)約1.8cm的7號針頭。將蛋平放于檢蛋燈上，插入針頭，并緩慢地向胚胎方向刺入。刺破羊膜囊時(shí)的一個(gè)證據，就是胚胎發(fā)生一個(gè)突然運動(dòng)。隨后稍將針頭回抽，并注入0.1～0.2ml接種物。蛋殼上的鉆孔用石蠟—凡士林混合物封閉，將蛋直立，繼續孵育。
（3）羊水的采集 象尿囊腔和卵黃囊收獲方法那樣除去蛋殼。在氣室底上滴加幾滴生理鹽水，使膜透明。以胚胎的眼睛作為參考依據，用連接一個(gè)短的6號針頭的注射器吸取羊水。
5．其他
（1）靜脈內 這一雞胚接種方法實(shí)際上不常用。操作時(shí)應用12～14日齡的雞胚。以檢蛋法標記出一根大靜脈。如前述方法除去該靜脈上方的一小塊四方形蛋殼。滴加1小滴滅菌礦物油于內殼膜上，使其變?yōu)橥该�。將一連接在小注射器上的4號針頭順血流方向插入于靜脈內。隨后注入0.1～0.5ml的接種物。如前述，孵育并收獲。
（2）腦內 這是培養狂犬病毒時(shí)偶而使用的方法。
