真菌的分離培養及形態(tài)觀(guān)察

真菌分離培養應考慮所分離真菌的特性，配制合適的培養基，選擇所需的氣體環(huán)境。同時(shí), 由于真菌分離材料常污染有大量細菌，所以可在培養基中加入抗菌素并在分離培養過(guò)程中嚴格執行無(wú)菌操作。

目的要求

1．掌握真菌分離培養方法。

2．認識真菌菌落的特征，比較與細菌菌落有何不同。

3．了解真菌載片培養法。

4．掌握觀(guān)察真菌的基本方法，并觀(guān)察其形態(tài)特征。

操作步驟

—、真菌的分離培養方法

（－）平板劃線(xiàn)分離法

1．取適合真菌的瓊脂培養基融化，冷至45℃，注入無(wú)菌平皿中，每皿15～20ml，制成平板待用。

2．取要分離的材料（如田土、混雜的或污染的真菌培養物、真菌）少許，投入盛無(wú)菌水的試管內，振搖，使分離菌懸浮于水中。

3．將接種環(huán)經(jīng)火焰滅菌并冷卻后，蘸取上述菌懸浮液，進(jìn)行平板劃線(xiàn)(同細菌的劃線(xiàn)法)。

4．劃線(xiàn)完畢，置溫箱中培養2～5d，待長(cháng)出菌落后，釣取可疑單個(gè)菌落先作制片檢查，若只有一種所需要的真菌生長(cháng)，即可進(jìn)行釣菌純培養。如有雜菌可從單個(gè)菌落中釣少許菌制成懸液，再作劃線(xiàn)分離培養，有時(shí)需反復多次，才得純種。另外，也可在放大鏡的觀(guān)察下，用無(wú)菌鑷子夾取一段待分離的真菌菌絲，直接放在平板上作分離培養，可獲得該種真菌的純培養。

（二）稀釋分離法

1．取盛有無(wú)菌水的試管5支（每管9ml），分別標記1、2、3、4、5號。取樣品（如田土等）1g，投入1號管內，振搖，使懸浮均勻。

2．用1ml滅菌吸管，按無(wú)菌操作法，從1號管中吸取1ml懸浮液注入2號管中，并搖勻；同樣由2號管取1ml至3號管，依此類(lèi)推，直至5號管。注意每稀釋一管應更換一支滅菌吸管。

3．用2支無(wú)菌吸管分別由4號、5號試管中各取1ml懸液，并分別注入2個(gè)滅菌培養皿中，再加入融化后冷至45℃的瓊脂培養基約15ml，輕輕在桌面上搖轉，靜置，使冷凝成平板。然后倒置溫箱中培養，2～5d后，從中挑選單個(gè)菌落，并移植于斜面上。

二．真菌培養性狀觀(guān)察

（一）真菌在固體培養基上的生長(cháng)表現

1 .酵母菌菌落：酵母菌在固體培養基上多呈油脂狀或蠟脂狀，表面光滑、濕潤、黏稠，有的表面呈粉粒狀、粗糙或皺褶。菌落邊緣有整齊、缺損或帶絲狀。菌落顏色有乳白色、黃色或紅色等。

2. 霉菌菌落：將不同霉菌在固體培養基上培養2～5d，可見(jiàn)霉菌菌落呈絨毛狀、絮狀、蜘蛛網(wǎng)狀等。菌落大小依種而異，有的能擴展到整個(gè)固體培養基，有的有一定的局限性（直徑1～2mm或更�。�。很多霉菌的孢子能產(chǎn)生色素，致使菌落表面、背面甚至培養基呈現不同的顏色，如黃色、綠色、青色、黑色、橙色等。   

（二）真菌在液體培養基中的生長(cháng)表現

1. 酵母菌  注意觀(guān)察其混濁度、沉淀物及表面生長(cháng)性狀等。

2. 霉菌  霉菌在液體培養基中生長(cháng)，一般都在表面形成菌層，且不同的霉菌有不同的形態(tài)和顏色。

    三． 真菌的形態(tài)觀(guān)察

（一）真菌水浸片的制備及觀(guān)察

常用美蘭染色液制備真菌水浸片來(lái)觀(guān)察真菌的菌體形態(tài)，并且活細胞能還原美藍為無(wú)色，故可區別死細胞、活細胞。

1. 酵母菌水浸片的制備

將美蘭染色液一滴滴加在干凈的載玻片中央，如不染色則加蒸餾水一滴，用接觸環(huán)以無(wú)菌操作取培養48h左右的酵母菌體少許，在液滴中輕輕涂抹均勻（液體培養物可直接取一接種環(huán)培養液于玻片上）并加蓋干凈蓋玻片。為避免產(chǎn)生氣泡，應先將其一邊接觸液滴，再慢慢放下蓋片。然后置于顯微鏡載物臺上進(jìn)行觀(guān)察，注意酵母菌的形態(tài)、大小和芽體，同時(shí)可以根據是否染上顏色來(lái)區別死、活細胞。

2. 霉菌水浸片的制備

在干凈載玻片上加蒸餾水或美蘭染色液一滴。取培養2～5d的根霉或毛霉、培養3～5d的曲霉、青霉或木霉、培養2d左右的白地霉同上法制片。霉菌要選擇有無(wú)性孢子的菌體，用解剖針挑取少量菌絲體放在載玻片的液滴中，將玻片置于解剖鏡下，細心地用解剖針將菌絲體分散成自然狀態(tài)，然后加蓋玻片，注意不要讓其產(chǎn)生氣泡，蓋后不再移動(dòng)玻片，以免弄亂菌絲。制好片后，就可以在顯微鏡下觀(guān)察。

觀(guān)察時(shí)注意它們的菌絲有無(wú)隔膜、孢子囊柄與分生孢子柄的形狀、分生孢子小梗的著(zhù)生方式、孢子囊的形態(tài)、足細胞與假根的有無(wú)、孢子囊孢子和分生孢子的形狀和顏色、節孢子的形狀和特點(diǎn)等。并且要區別根霉與毛霉、青霉、曲霉、木霉之間的異同點(diǎn)以及白地霉的特點(diǎn)。 

（二）霉菌封閉標本的制備

霉菌的封閉標本，常用乳酸石炭酸液封片，其中含有的甘油使標本不宜干燥，而石炭酸又有防腐作用。在封片液中，還可加入棉藍或其它酸性染料，以便于觀(guān)察菌體。

在潔凈載玻片上滴一滴乳酸石炭酸棉藍染色液，用解剖針從霉菌菌落的邊緣處取少許帶有孢子的菌絲于染液中，再細心地把菌絲挑成自然狀態(tài)，然后用蓋玻片蓋上，注意不要產(chǎn)生氣泡。在溫暖干燥室內放數日，讓水分蒸發(fā)一部分，使蓋玻片與載玻片緊貼，即可封片。封片時(shí)，先用清潔的紗布或脫脂棉將蓋玻片四周擦凈，并在蓋玻片周?chē)�涂一圈加拿大�?shù)膠或合成樹(shù)膠，風(fēng)干后即成封閉標本。

（三）真菌的載片培養

真菌的載片培養法不僅可克服水浸片制片的困難，還可使對菌絲分枝和孢子著(zhù)生狀態(tài)的觀(guān)察獲得更滿(mǎn)意的效果。

取直徑7cm左右圓形濾紙一張，鋪放于一個(gè)直徑9cm的平皿底部（圖5-1），上放一U形玻棒，其上再平放一張干凈的載玻片與一張蓋玻片，蓋好平皿蓋進(jìn)行滅菌。挑取真菌孢子接入盛有滅菌水的試管中，搖振試管制成孢子懸液備用。用滅菌滴管吸取滅菌后融化的真菌固體培養基少許，滴于上述滅菌平皿內的載玻片中央，并以接種環(huán)將孢子懸液接種在培養基四周，加上蓋玻片，并輕輕壓貼一下。為防止培養過(guò)程中培養基干燥，可在濾紙上滴加滅菌20％甘油液3～4ml，然后蓋上平皿蓋，即成所謂濕室載片培養。放在適宜溫度（多數真菌為20～30℃）的培養箱內培養，定期取出在低倍鏡下觀(guān)察，可以看到孢子萌發(fā)、發(fā)芽管的長(cháng)出、菌絲的生長(cháng)、無(wú)隔菌絲中孢子囊柄與孢子囊孢子形成的過(guò)程、有隔菌絲上足細胞生長(cháng)、鎖狀聯(lián)合的發(fā)生、孢子著(zhù)生狀態(tài)等。

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