厭氧性細菌分離培養法

細菌接種后，直接放在恒溫箱內培養，可以使需氧菌與兼性厭氧菌生長(cháng)繁殖；但對厭氧菌，則需將培養環(huán)境或培養基中的氧氣除去，或將氧化型物質(zhì)還原，降低其氧化還原電勢，才能生長(cháng)繁殖。在有氧的環(huán)境下，培養基的氧化還原電勢較高，不適于厭氧菌的生長(cháng)。為使培養基降低電勢，降低培養環(huán)境的氧分壓是十分必要的�，F有的厭氧培養法很多，主要有生物學(xué)法、化學(xué)法和物理學(xué)法，可根據各實(shí)驗室的具體情況而選用。

（一）生物學(xué)方法

培養基中含有植物組織（馬鈴薯、燕麥、發(fā)芽谷物等）或動(dòng)物組織（新鮮動(dòng)物組織小片，或加熱的肌肉、心腦等），因組織的呼吸作用，以及組織中可氧化物質(zhì)的氧化而消耗氧氣（肌肉、腦磷脂中不飽和脂肪酸的氧化，碎肉培養基的應用），造成厭氧環(huán)境，以利于厭氧性細菌的生長(cháng)繁殖。同時(shí)，組織中所含的還原性化合物（谷胱甘肽）也可使氧化-還原電勢下降。

此外，將厭氧菌與需氧菌共同培養在同一環(huán)境中，則環(huán)境中的氧被需氧菌消耗，造成厭氧環(huán)境，也有利于厭氧菌的生長(cháng)繁殖。

1. 動(dòng)物組織及其他物質(zhì)加入法  在液體培養基內加入肝臟、腎臟等動(dòng)物臟器，因其中的半胱氨酸的一SH基極不穩定，為強還原劑，所以可利用此培養基進(jìn)行厭氧培養，在培養之前將肝片肉湯加熱，以驅出空氣，冷卻，然后接種培養。

2. 共棲培養法  將厭氧菌與需氧菌共同培養在同一個(gè)平皿內，利用需氧菌的生長(cháng)繁殖將氧氣消耗后，造成厭氧環(huán)境利于厭氧菌生長(cháng)。其具體方法是將培養皿的一半接種消耗氧氣能力極強的需氧菌如靈桿菌、大腸桿菌、枯草桿菌等。另一半接種厭氧菌， 接種后將平皿倒扣在一塊玻璃板上，并用石蠟密封，置37℃恒溫箱中培養2～3d， 即可觀(guān)察到需氧菌和厭氧菌均先后生長(cháng)。

（二）化學(xué)方法

利用還原能力強的化學(xué)物質(zhì)，將環(huán)境或培養基內的氧氣消耗，或還原氧化型物質(zhì)，降低氧化-還原電勢。

1. 焦性沒(méi)食子酸法  焦性沒(méi)食子酸在堿性溶液內能大量地吸收氧而造成厭氧環(huán)境，有利于厭氧菌的生長(cháng)繁殖。通常100cm³空間用焦性沒(méi)食子酸1g及10％氫氧化鈉或氫氧化鉀10m1。具體方法有下列幾種：

（1）平板培養法  將厭氧菌劃線(xiàn)接種于適宜的瓊脂平板，取一小團直徑約2cm的脫脂棉，置于平皿蓋的內面中央，其上滴加0.5ml 10％氫氧化鈉溶液；在靠近脫脂棉的一側放置0.5g焦性沒(méi)食子酸，暫勿使兩者接觸。立即將已接種的平板覆蓋于平皿蓋上，迅速用融化的石蠟密封平皿四周。封畢，輕輕搖動(dòng)平皿，使被氫氧化鈉溶液浸濕的脫脂棉與焦性沒(méi)食子酸接觸，然后置37℃恒溫箱中培養24～48h后，取出觀(guān)察。

（2）Buchner氏試管法（圖4-4）  取一大試管，在管底放焦性沒(méi)食子酸0.5g及玻璃珠數個(gè)或放一螺旋狀鉛絲。將已接種的培養管放入大試管中，迅速加入2％NaOH溶液0.5ml，立即將試管口用橡皮塞塞緊，必要時(shí)周?chē)�用石蠟密封�?/SPAN>37℃培養24～48h后觀(guān)察。

（3）瑞氏厭氧培養法（圖4-5）  將已接種細菌的培養管的脫脂棉棉塞在火焰中灼燒滅菌后，塞入管中離培養基1～1.5cm處，置適量焦性沒(méi)食子酸于其上，加入10%NaOH溶液2ml，迅速用橡皮塞將管口塞緊，以膠泥或石蠟嚴密封閉置溫箱中培養。

（4）史氏厭氧培養法  用圖4-6所示的厭氧培養皿，在皿底一邊置焦性沒(méi)食子酸，另一邊置NaOH溶液，將已接種的平皿翻蓋于皿上，并將接合處用膠泥或石蠟密封，然后搖動(dòng)底部，使氫氧化鈉與焦性沒(méi)食子酸混合，置溫箱中培養。

（5）平皿厭氧培養法  置一片中有小圓孔的金屬板于兩平皿之間，上面的平皿接種細菌，下面的平皿盛焦性沒(méi)食子酸及氫氧化鈉溶液，用膠泥封閉后置溫箱中培養（圖4-7）

（6）玻罐或干燥器法  置適量焦性沒(méi)食子酸于一干燥器或玻罐的隔板下面，將培養皿或試管置于隔板上，并在玻罐內置美蘭指示劑一管，從罐側加入氫氧化鈉溶液于罐底，將焦性沒(méi)食子酸用紙或紗布包好，用線(xiàn)系住，暫勿與氫氧化鈉接觸，等一切準備好后，將線(xiàn)放下，使焦性沒(méi)食子酸落入氫氧化鈉溶液中，立即將蓋蓋好，密封，置溫箱中培養。

    2. 李伏夫（B.M.JIbBOB）氏法  此法是利用連二亞硫酸鈉（Sodium hyerosulphite）和碳 酸鈉以吸收空氣中的氧氣,釋放二氧化碳造成厭氧環(huán)境。其反應式如下：

Na₂S₂O₄+Na₂CO₃+O₂→Na₂SO₄+Na₂SO₃+CO₂

取一有蓋的玻璃罐，罐底墊一薄層棉花，將接種好的平皿重疊正放于罐內（如是液體培養基，則直立于罐內），最上端保留可容納1～2個(gè)平皿的空間（視玻罐的體積而定），按玻罐的體積每1000cm³空間用連二亞硫酸鈉及碳酸鈉各30g，在紙上混勻后，盛于上面的空平皿中，加水少許使混合物潮濕，但不可過(guò)濕，以免罐內水分過(guò)多。若用無(wú)蓋玻罐，可將平皿重疊正放在淺底容器上，以無(wú)蓋玻罐置于皿上，罐口周?chē)�用膠泥或水銀封閉,如圖4-8所示。

3. 硫乙醇酸鈉法  硫乙醇酸鈉是一種還原劑，加入培養基中，能除去其中的氧或還原氧化型物質(zhì)，促使厭氧菌生長(cháng)。其它可用的還原劑包括葡萄糖、維生素C及半胱氨酸等。

（1）液體培養基法  將細菌接入含0.1%的硫乙醇酸鈉液體培養基中，并加入美蘭溶液作為氧化還原的指示劑，37℃培養24～48h后觀(guān)察，在無(wú)氧條件下，美蘭被還原成無(wú)色。

（2）固體培養基法  利用特殊構造的Brewer氏培養皿，可使厭氧菌在培養基表面生長(cháng)而形成孤立的菌落。具體方法如下：先將Brewer氏培養皿干熱滅菌，將溶化冷卻至50℃左右的硫乙醇酸鈉固體培養基傾入皿內。待瓊脂冷凝后，將厭氧菌接種于培養基的中央部分。蓋上皿蓋，使皿蓋內緣與培養基外圍部分相互緊密接觸（圖4-9）。此時(shí)皿蓋與培養基中央部分留在空隙間的氧氣被硫乙醇酸鈉還原，美蘭指示劑逐漸褪色，而外緣部分，因與大氣相通，仍呈藍色。將Brewer氏培養皿于37℃恒溫箱內24～48h后觀(guān)察。

（三） 物理學(xué)方法

利用加熱、密封、抽氣等物理方法，以驅除或隔絕環(huán)境及培養基中的氧氣，造成厭氧環(huán)境，有利于厭氧菌的生長(cháng)繁殖。

1. 厭氧罐法  常用的厭氧罐有Brewer氏罐、Brown氏罐和Mc1gtosh－Fildes二氏罐（圖4-10）。將接種好的厭氧菌培養皿依次放于厭氧罐中，先抽去部分空氣，代以氫氣至大氣壓。通電，使罐中殘存的氧與氫經(jīng)受鉑或鈀的催化而化合成水，使罐內氧氣全部消失。將整個(gè)厭氧罐放入溫箱培養。

2. 真空干燥器法  將接種好的平皿或試管放入真空干燥器中，開(kāi)動(dòng)抽氣機，抽至高度真空后，替代以氫、氮或二氧化碳氣體。將整個(gè)干燥器放進(jìn)孵育箱中培養。

3. 加熱密封法  將液體培養基放在阿諾氏鍋內加熱10min，驅除溶解液體中的空氣，取出，迅速置于冷水中冷卻。接種厭氧菌后，在培養基液面覆蓋一層0.5cm的無(wú)菌凡士林石蠟。置37℃培養24～48h后觀(guān)察。

4. 高層瓊脂柱法  加熱融化一管適合分離厭氧菌用的瓊脂培養基，待冷至50℃左右，接入少許經(jīng)適當稀釋的待分離的培養物或含菌材料，充分搖震均勻。在瓊脂凝固前，迅速以無(wú)菌滴管吸取上述已接種的瓊脂培養基，注入準備好的玻璃管內（長(cháng)約15 cm，一端塞小膠塞或小木塞，另一端塞棉花塞，高壓滅菌備用），裝至4／5左右之處，塞好棉花塞，放在大試管或玻璃筒內，置37℃恒溫箱中培養。長(cháng)出菌落后，拔去膠塞和棉花塞，以無(wú)菌玻棒將瓊脂柱推出于無(wú)菌平皿中，再用滅菌接種環(huán)釣取獨立菌落作厭氧純培養。

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