需氧性細菌分離培養法

需氧性細菌分離培養法

1. 平板劃線(xiàn)分離法

菌種被其他雜菌污染時(shí)或混合菌懸液常用平板劃線(xiàn)法進(jìn)行純種分離，此法是借助將蘸有混合菌懸液的接種環(huán)在平板表面多方向連續劃線(xiàn)，使混雜的微生物細胞在平板表面分散，經(jīng)培養得到分散的由單個(gè)微生物細胞繁殖而成的菌落，從而達到純化目的。 但劃線(xiàn)分離的培養基必須事先傾倒好，需充分冷凝待平板稍干后才可使用；為便于劃線(xiàn)，一般培養基不宜太薄，每皿約傾倒20 ml培養基，培養基應厚薄均勻，平板表面光滑。劃線(xiàn)分離主要有連續劃線(xiàn)法（圖4-1）和分區劃線(xiàn)法（圖4-2）兩種。劃線(xiàn)法示意圖見(jiàn)圖4-3。

（1）連續劃線(xiàn)法

(2)分區劃線(xiàn)法（四分區劃線(xiàn)法）

取菌、接種、培養方法與“連續劃線(xiàn)法”相似。分區劃線(xiàn)法劃線(xiàn)分離時(shí)平板分4個(gè)區，故又稱(chēng)四分區劃線(xiàn)法。其中第4區是單菌落的主要分布區，故其劃線(xiàn)面積應最大。為防止第4區內劃線(xiàn)與1、2、3區線(xiàn)條相接觸，應使4區線(xiàn)條與1區線(xiàn)條相平行，這樣區與區間線(xiàn)條夾角最好保持120度左右。先將接種環(huán)蘸取少量菌在平板上1區劃3-5條平行線(xiàn)，取出接種環(huán)，左手關(guān)上皿蓋，將平板轉動(dòng)60～70度。灼燒接種環(huán)，待在平板邊緣上冷卻后，再按以上方法以1區劃線(xiàn)的菌體為菌源，由1區向2區作第2次平行劃線(xiàn)。第2次劃線(xiàn)完畢，同時(shí)再把平皿轉動(dòng)約60～70度，同樣依次在3、4區劃線(xiàn)。劃線(xiàn)完畢，灼燒接種環(huán)，關(guān)上皿蓋，倒置于37℃恒溫箱中培養24h后，在劃線(xiàn)區觀(guān)察單菌落。

2. 傾注平皿分離法

被檢材料若含有兩種或兩種以上細菌時(shí),可借助溶化的瓊脂將細菌稀釋?zhuān)�待瓊脂冷凝�?/SPAN>,分散的細菌就被固定在原地形成菌落.這樣也能達到分得純種的目的。根據材料中存在菌數的多少，傾注平皿前可將被檢材料不稀釋或用生理鹽水作適當稀釋。其具體方法如下：

取三支預先準備的普通瓊脂培養基試管，水浴加熱融化，冷至約50℃，用火焰滅菌接種環(huán)釣取待分離物接種至第一管內，充分搖勻后，自第一管取一接種環(huán)內容物至第二管，以同樣方法自第二管移種至第三管。然后分別傾注一個(gè)已滅菌的平皿，凝固后倒轉置于37℃溫箱內培養24h。結果多數細菌在瓊脂內生長(cháng)成菌落，僅少數菌落出現在表面，通常第一個(gè)平板內的菌落數較多而密集，第二、三個(gè)平板則逐漸減少，可見(jiàn)單個(gè)菌落。

3. 芽胞需氧菌分離培養法

如果被檢材料中可疑有帶芽孢的細菌，可先將被檢材料加少量生理鹽水或肉湯，置于80℃水浴箱中維持15～20分鐘，或85℃加熱10分鐘，再進(jìn)行培養。材料中若有帶芽孢的細菌仍可存活而生長(cháng)繁殖，不耐熱的細菌繁殖體則被殺滅。

4．利用化學(xué)藥品的分離培養法

（1）抑菌作用  有些藥品對某些細菌有極強的抑制作用，而對另外一些細菌沒(méi)有抑制作用，所以可利用這種特性進(jìn)行細菌的分離，例如通常在培養基中加入結晶紫或青霉素等化學(xué)藥品來(lái)抑制革蘭氏陽(yáng)性菌的生長(cháng)，以分離得到革蘭氏陰性菌。

（2）殺菌作用  將病料如結核病料用15％硫酸溶液處理，其他雜菌均被殺死，而結核桿菌因具有抗酸性而存活。

（3）鑒別作用  利用細菌對某種糖的分解能力，通過(guò)培養基中指示劑的變化來(lái)鑒別某種細菌。例如遠藤氏培養基可以用來(lái)鑒別大腸桿菌與沙門(mén)氏桿菌。

5. 實(shí)驗動(dòng)物分離法

被檢病料中疑有某種病原菌存在，可將病料以無(wú)菌操作取出，放入滅菌乳缽或組織勻漿器內，加3～5倍量無(wú)菌生理鹽水制成混懸液，吸取一定量混懸液注射（肌肉、腹腔、皮下或靜脈）入易感實(shí)驗動(dòng)物,待實(shí)驗動(dòng)物死后，取其臟器，�？煞蛛x到純的病原菌。例如，疑有豬丹毒桿菌存在的病料，可注射于鴿體，鴿死后，再取其脾臟以分離豬丹毒桿菌，可得到純培養。

6. 瓊脂斜面分離法

取瓊脂斜面3管，用接種環(huán)蘸取欲檢病料少許（如為臟器，先將表面燒烙后，用滅菌解剖刀切開(kāi)，以滅菌接種環(huán)由切口插入、轉動(dòng)、釣取組織），混合于第1管的凝集水中，再作斜面劃線(xiàn)；然后抽出接種環(huán)，不經(jīng)燒灼，繼續在第2管、第3管斜面上作同樣劃線(xiàn)。劃畢，置37℃溫箱中培養。經(jīng)此法分離培養后，第2管的菌落較第1管為少，第3管的菌落更少，如此較易得到單個(gè)菌落，達到純培養之目的。

7. 瓊脂平板涂布分離法

被檢病料如血液、腹水等，可用滅菌毛細吸管或吸管吸取 1～2滴置于平板中央，用滅菌的L形玻棒作均勻涂布。如估計細菌數很多，可直接用火焰滅菌的接種環(huán)釣菌，并做分區劃線(xiàn)。如為臟器病料，可先作成乳懸液再行涂布；或取其一小塊，用鑷子夾住，表面燒烙后，用滅菌刀切開(kāi)，以其切面直接進(jìn)行涂布，此法適用于含菌量較少的病料的分離。

8. 營(yíng)養肉湯分離法

當組織病料中含病原菌少，或有抗菌藥殘留時(shí)，用上述瓊脂斜面或平板分離法可能無(wú)菌落長(cháng)出，這時(shí)可以無(wú)菌操作剪取一小塊病料直接投入肉湯，經(jīng)37℃培養，在肉湯中長(cháng)出細菌后，再用瓊脂斜面或瓊脂平板分離。

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