一、實(shí)驗目的：掌握微生物斜培養基確定方法，學(xué)會(huì )對已確定菌種確定實(shí)驗室發(fā)酵工藝。
二、實(shí)驗原理：篩選微生物最適生長(cháng)及產(chǎn)物形成的營(yíng)養條件和培養條件，以確定特定產(chǎn)物發(fā)酵的工藝參數。
三、儀器及試劑 ：蔗糖，酵母膏，MgSO4等
高壓滅菌鍋、潔凈工作臺、恒溫振蕩培養箱。
四、操作方法：
1、種子培養基
2、產(chǎn)酶培養基確定
2.1培養基的配制，各組分別選擇以下六種培養基配方：
（1）基礎培養基：（100ml）豆粕粉3g，蔗糖0.8g，酵母膏0.1g，MgSO4 0.36g，KH2PO4 0.12g，CaCl2 0.1g。（第一組）
（2）第二組，將基礎培養基中蔗糖按成等例葡萄糖；
（3）第三組，將基礎培養基中蔗糖按成等例馬鈴薯淀粉；
（4）第四組，將基礎培養基中去掉酵母膏；
（5）第五組，將基礎培養基中去掉豆粕粉，并將酵母膏添加量增至0.5％。
（6）第六組，將基礎培養基中去掉MgSO4 和CaCl2。
2.2培養基滅菌
高壓滅菌鍋，121℃，20min滅菌。冷卻至室溫，將上述物品并洗耳球轉入超凈臺，接種前20min進(jìn)行紫外空氣滅菌。
2.3接種
冷卻到室溫開(kāi)始接種，接種量10％，然后在在28℃、250r/m的條件下培養至發(fā)酵液顏色變深、澄清為止。
2.4酶活力測定
根據各組測定酶活結果，比較確定適宜培養基組成。
（1）定義：1 g固體酶粉，在一定溫度和pH值條件下，1 min水解酪素產(chǎn)生1 ug酪氨酸為一個(gè)酶活單位，以u/g表示。
（2）原理：蛋白酶在一定溫度與pH條件下，水解酪素底物，然后加入三氯乙酸終止酶反應，并使未水解的酪素沉淀除去，濾液對紫外光有吸收，可用紫外分光光度法測定。根據吸光度計算其酶活力。
（3）試劑和溶液
① 三氯乙酸（CCl3.COOH）=0.4 mol/L：稱(chēng)取三氯乙酸32.7 g，用水溶解并定容至500 mL
② 磷酸緩沖溶液
③ 100 ug/mL L—酪氨酸標準溶液
④ 10 g/L酪素溶液
⑤ 待測酶液：取1ml發(fā)酵液稀釋備用。
（4）分析步驟
① 求K值
② 測定
a. 先將酪素溶液放入（40±0.2）攝氏度恒溫水域中，預熱5 min；
b. 按下列程序操作：
試管A（空白） （第二試管） 試管B（酶試樣，作三個(gè)平行樣）（第三試管）
↓ ↓
加酶液2.00 mL （移液管2ml） 加酶液2.00 mL
↓（40±0.2℃），2 min ↓（40±0.2℃），2 min
加三氯乙酸4.00 mL（搖勻）（移液管5ml） 加酪素2.00 mL（搖勻）
↓（40±0.2℃），10 min ↓（40±0.2℃），10 min
加酪素2.00 mL（搖勻）（移液管2ml） 加三氯乙酸4.00 mL（搖勻）
↓ ↓
取出靜止10 min，過(guò)濾 （第四試管，小漏斗） 取出靜止10 min，過(guò)濾
↓ ↓
在275 nm波長(cháng)下，用 10 mm 在275 nm波長(cháng)下，用 10 mm
比色皿測其吸光度 比色皿測其吸光度
（5）計算（=135）
X=A×K×8/2×1/10×n×E=2/5×A×K×n×E
式中 X——樣品的酶活力（u/g） A——試樣溶液的平均吸光度
K——吸光常數（K=135） 8——反應試劑的總體積（mL）
2——吸取酶液2.00 mL，以1 mL計 1/10——反應時(shí)間10 min，以1 min計
n——稀釋倍數 E——紫外法與福林法的換算系數（取0.50）
五、實(shí)驗進(jìn)程安排及結果分析
（1）第1次實(shí)驗：配制培養基，滅菌，等待滅菌時(shí)進(jìn)行發(fā)酵罐的上罐觀(guān)察。
（2）第2次實(shí)驗：下?lián)u瓶，測定發(fā)酵液中蛋白酶活力，對比各組實(shí)驗，確定培養基；或從發(fā)酵罐上取樣，測定發(fā)酵液中蛋白酶活力。
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