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一、實(shí)驗目的
了解稀釋平板計數的原理，掌握涂抹平板培養法和混合平板培養法，認識細菌、放線(xiàn)菌、霉菌的菌落特征。
二、實(shí)驗原理
稀釋平板計數是根據微生物在固體培養基上所形成的單個(gè)菌落，即是由一個(gè)單細胞繁殖而成這一培養特征設計的計數方法，即一個(gè)菌落代表一個(gè)單細胞。計數時(shí)，首先將待測樣品制成均勻的系列稀釋液，盡量使樣品中的微生物細胞分散開(kāi)，使成單個(gè)細胞存在（否則一個(gè)菌落就不只是代表一個(gè)細胞），再取一定稀釋度、一定量的稀釋液接種到平板中，使其均勻分布于平板中的培養基內。經(jīng)培養后，由單個(gè)細胞生長(cháng)繁殖形成菌落，統計菌落數目，即可計算出樣品中的含菌數。此法所計算的菌數是培養基上長(cháng)出來(lái)的菌落數，故又稱(chēng)活菌計數。一般用于某些成品檢定（如殺蟲(chóng)菌劑等）、生物制品檢驗、土壤含菌量測定及食品、水源的污染程度的檢驗。
三、實(shí)驗器材
1．活材料：蘇云金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis）菌劑。
2．培養基：牛肉膏蛋白胨瓊脂培養基（附錄三、1）
3．器材：90ml無(wú)菌水、9ml無(wú)菌水、無(wú)菌平皿、lml無(wú)菌吸管、天平、稱(chēng)樣瓶、記號筆、玻璃刮鏟等。
四、實(shí)驗方法
1．樣品稀釋液的制備 準確稱(chēng)取待測樣品l
圖22-1 平板計數法中樣品的稀釋和稀釋液的取樣培養
用稀釋平板計數時(shí)，待測菌稀釋度的選擇應根據樣品確定。樣品中所含待測菌的數量多時(shí)，稀釋度應高，反之則低。通常測定細菌菌劑含菌數時(shí)，采用10-7、10-8、10-9稀釋度，測定土壤細菌數量時(shí)，采用10-4、10-5、10-6稀釋度，測定放線(xiàn)菌數量時(shí)，采用l0-3、10-4、10-5稀釋度，測定真菌數量時(shí)，采用10-2、10-3、10-4稀釋度。
2．平板接種培養 平板接種培養有混合平板培養法和涂抹平板培養法兩種方法。
（1）混合平板培養法 將無(wú)菌平板編上10-7、10-8、10-9號碼，每一號碼設置三個(gè)重復，用無(wú)菌吸管按無(wú)菌操作要求吸取10-9稀釋液各1ml放入編號10-9的3個(gè)平板中，同法吸取10-8稀釋液各lml放入編號10-8的3個(gè)平板中，再吸取10-7稀釋液各lml放入編號10-7的3個(gè)平板中（由低濃度向高濃度時(shí)，吸管可不必更換）。然后在9個(gè)平板中分別倒入已融化并冷卻至45—
（2）涂抹平板計數法 涂抹平板計數法與混合法基本相同，所不同的是先將培養基熔化后趁熱倒入無(wú)菌平板中，待凝固后編號，然后用無(wú)菌吸管吸取0.1ml菌液對號接種在不同稀釋度編號的瓊脂平板上（每個(gè)編號設三個(gè)重復）。再用無(wú)菌刮鏟將菌液在平板上涂抹均勻（圖22-3），每個(gè)稀釋度用一個(gè)滅菌刮鏟，更換稀釋度時(shí)需將刮鏟灼燒滅菌。在由低濃度向高濃度涂抹時(shí)，也可以不更換刮鏟。將涂抹好的平板平放于桌上20—30min，使菌液滲透入培養基內，然后將平板倒轉，保溫培養，至長(cháng)出菌落后即可計數。
五、實(shí)驗作業(yè)：
將實(shí)驗結果填入下表中
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稀釋度 |
10-7 |
10-8 |
10-9 | |||||||||
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菌落數 |
1 |
2 |
3 |
平均 |
1 |
2 |
3 |
平均 |
1 |
2 |
3 |
平均 |
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計算結果時(shí)，常按下列標準從接種后的3個(gè)稀釋度中選擇一個(gè)合適的稀釋度，求出每克菌劑中的含菌數。
（1）同一稀釋度各個(gè)重復的菌數相差不太懸殊。
（2）細菌、放線(xiàn)菌、酵母菌以每皿30—300個(gè)菌落為宜，霉菌以每皿10—100個(gè)菌落為宜。
選擇好計數的稀釋度后，即可統計在平板上長(cháng)出的菌落數，統計結果按下式計算。
混合平板計數法：
每克樣品的菌數=同一稀釋度幾次重復的菌落平均數×稀釋倍數
涂抹平板計效法：
每克樣品的菌數=同一稀釋度幾次重復的菌落平均數×10×稀釋倍數。
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