艱難梭菌及其檢測技術(shù)研究進(jìn)展

 

艱難梭菌又叫“艱難梭狀芽孢桿菌”，最早發(fā)現于上世紀30年代，是造成醫院感染和住院病患腹瀉的常見(jiàn)細菌。普通人群中約有3%的人的腸胃中都有這種細菌，在正常情況下，該細菌受制于人體內的其他細菌，不會(huì )危害人體健康。但對于長(cháng)期或是大量服用抗生素的病人而言，這種細菌是可怕的，甚至是致命的。這是由于藥物破壞了人體腸胃中各種菌類(lèi)之間的平衡，所以容易導致“艱難梭菌”感染。就“艱難梭菌”本身而言，其致命性并不高，在0.6%到1.5%之間，但由于感染該細菌通常會(huì )伴隨偽膜性結腸炎的出現，一旦出現這種情況，死亡率就會(huì )猛增到35%到50%。而且，與所有的細菌一樣，“艱難梭菌”會(huì )通過(guò)突變產(chǎn)生新的變種，而這些變種細菌的毒性和對人體的危害性、致命性通常也更強。

 

所有艱難梭菌菌株皆表達抗原谷氨酸脫氫酶，但是艱難梭菌分為產(chǎn)毒菌株和不產(chǎn)毒菌株兩種。僅產(chǎn)毒菌株分泌毒素A和毒素B。毒素A和毒素B都可以導致艱難梭菌相關(guān)疾病的發(fā)生。艱難梭菌的檢測主要是通過(guò)對疑似病例的糞便中毒素的檢測完成^[1]。直接糞便毒素測定包括細胞毒素測定（CTA）和酶免疫測定（EIA）^[2]。CTA中毒素B的檢測被認為是艱難梭菌檢測的金標準^[3]。CTA涉及到將培養的細胞暴露到有或者沒(méi)有抗毒素存在的排泄抽提物中。如果排泄物樣本是艱難梭菌陽(yáng)性，則對沒(méi)有經(jīng)過(guò)抗毒處理的培養細胞有毒害作用^[4]。

艱難梭菌也可以通過(guò)在厭氧條件下培養而被檢測。這種方法具有很高的靈敏度，但是也很耗費時(shí)間，需要超過(guò)三天的時(shí)間。另外，這種方法不能區分產(chǎn)毒菌株和非產(chǎn)毒菌株。利用EIA對細菌培養分離株進(jìn)行進(jìn)一步測試，主要是鑒定艱難梭菌菌株是否產(chǎn)毒 ^[5]。

傳統實(shí)驗室的C.diff測驗都是根據以下三種方法中的一種或者結合幾種進(jìn)行的：細胞培養測定中的細胞毒素檢測； 艱難梭菌毒素A、腸毒素、或者毒素A和毒素B的酶免疫測定（EIA）檢測； 艱難梭菌的厭氧培養。^[6]

 

過(guò)濾的糞便抽提物加到微量滴定板上處于生長(cháng)的健康的單層細胞中，培養48h。如果樣本中存在細胞毒素（一般是艱難梭菌毒素B），將會(huì )導致單層細胞聚集，脫離板（稱(chēng)為細胞病變效應，CPE）。非特定細胞毒素的鑒別是通過(guò)加入向第二個(gè)孔（孔內有病人的糞便抽提物）加入特定的抗毒素（實(shí)際上是培育一種相似的微生物C. sordellii）。只有起始的CPE是由于艱難梭菌毒素B引起的，在相應的孔中抗毒素才會(huì )阻止CPE。一般認為，細胞毒素中和（CTN）測定是實(shí)驗室檢測中最靈敏和精確的，但是存在兩個(gè)主要的缺點(diǎn)：出結果的速度不夠快，從而影響了及時(shí)的臨床診斷；這種方法需要專(zhuān)業(yè)的技術(shù)和連續的組織培養^[7]。

 

一些商業(yè)產(chǎn)品通過(guò)檢測在主要存在于有生長(cháng)力的艱難梭菌細胞的一種蛋白質(zhì)，叫谷氨酸脫氫酶（GDH），結合毒素檢測。因為糞便中的毒素易分解，特別是如果在轉移到實(shí)驗室的過(guò)程中經(jīng)過(guò)耽誤，毒素測驗很可能會(huì )錯誤地成陰性，然而GDH是相當穩定的，通�？梢员砻魑⑸�物的存在。這種方法的缺點(diǎn)包括缺乏靈敏性，一些菌株毒素的改變使得不能被商業(yè)化產(chǎn)品檢測出來(lái)；一些無(wú)毒素的艱難梭菌也可分泌出GDH（假陽(yáng)性結果）；一次進(jìn)行這些檢測的費用；如果EIA測驗是成批進(jìn)行以提高工作流程和成本效益，將會(huì )使周轉時(shí)間延長(cháng)。

 

培養是所有檢測中最靈敏的方法。但是必須進(jìn)行二次檢測以判斷產(chǎn)物毒素是否存在，因為非毒性菌株還是比較常見(jiàn)的。這就延長(cháng)了出結果的周轉時(shí)間。另外，艱難梭菌的芽孢是極其堅固的，但是有生長(cháng)力的形式卻比較脆弱，必須維持厭氧環(huán)境以使其恢復生長(cháng)。一種特殊的介質(zhì)——環(huán)絲氨酸-頭孢西丁果糖瓊膠（CCFA），必須在厭氧環(huán)境下儲存并培養48h，以達到最佳的恢復。因為培養技術(shù)的困難和結果輸出的延遲，在相對很少的檢測性實(shí)驗室中會(huì )對艱難梭菌進(jìn)行培養。早先的研究區分疾病通常包括在內鏡檢查術(shù)下宏觀(guān)觀(guān)察粘膜的外觀(guān)，通過(guò)組織病理學(xué)比較（假膜是由剝落的細胞組成的白色或者黃色粗糙的物質(zhì)構成），或者在結腸粘膜的活體組織上觀(guān)察到的的微觀(guān)病變。目前這種有擴散性的檢測在今天已經(jīng)幾乎不被利用了，實(shí)驗室測驗是檢測的主要模式。這使得測驗和標準的選擇至關(guān)重要。

最近已經(jīng)有文獻報道了采用兩步方法后的更好的結果：對微生物本身非常靈敏的檢測，首先利用EIA檢測GDH，緊接著(zhù)對細胞毒素和中和的二次檢測。因為在所有病人的糞便標本中的艱難梭菌，對GDH的快速檢測將都是陽(yáng)性的，不管毒素的性質(zhì)是否已經(jīng)在運輸過(guò)程中分解，這種方法是最靈敏的。糞便在其最初的檢測中被認為是陰性的，即可立刻被報告時(shí)陰性的。因為第一個(gè)樣本是最有價(jià)值的�？醋o者可以進(jìn)行其他的檢測方法，并使得改變抗生素療法決定的立即必要性得到阻止。實(shí)驗室必須繼續進(jìn)行細胞毒素測定，這使得周轉時(shí)間增加，或者培養和毒素測驗的時(shí)間增加。然而，兩步方法是最有效的。

 

無(wú)論是CTA還是艱難梭菌培養都需要耗費大量時(shí)間和勞動(dòng)力 。艱難梭菌檢測時(shí)間的延長(cháng)將導致拖延對艱難梭菌陽(yáng)性個(gè)體的治療；鑒定為假陽(yáng)性可能導致使用抗生素應對個(gè)體艱難梭菌感染。這也可能導致個(gè)體被誤診為艱難梭菌感染，而與真正艱難梭菌陽(yáng)性病人共用同一間病房。

目前，一個(gè)更加致命的抗氟喹諾酮的限制性核酸內切酶B1族艱難梭菌菌株在世界很多地方已經(jīng)被越來(lái)越多地檢測出來(lái)^[8,9]。這種新型菌株是通過(guò)其產(chǎn)物雙毒素（CDT）及毒素A和毒素B抑制劑基因位點(diǎn)tcdC的部分缺失加以區別的。

由于與新克隆相關(guān)的增加的致病率和死亡率，病菌的檢測迫在眉睫，因為甲硝唑的效力逐漸下降，萬(wàn)古霉素應該盡可能地避免使用，甚至新的含益生菌的治療方法已經(jīng)流行起來(lái)^[10,11]。內科醫生確實(shí)需要一種更加可信和效率的檢測。

 

    目前市場(chǎng)上有很多艱難梭菌快速檢測方法，其中以Meridian Premier C. difficile Toxin A+B ELISA, TechLab Tox A/B Quik Chek, TechLab Toxin A/B II, ImmunoCard Toxin A&B的檢測效果相對較好。ImmunoCard Toxin A&B test最大化地縮短了檢測時(shí)間，整個(gè)過(guò)程為16-24分鐘。另外，這種測驗是一個(gè)單項測驗EIA，可能在臨時(shí)檢測的應用上是實(shí)用可行的。其他的快速檢測方法需要自動(dòng)板閱讀設備、板清洗機、離心機或者一些消耗品（如不包括在檢測試劑盒在內的準備試劑盒等）。大多數的研究都強調，需要更加縝密的方法如CTA或者厭氧培養等，以確認快速檢測的結果。另外，快速檢測可以用來(lái)作為鑒定艱難梭菌陽(yáng)性個(gè)體的初步的篩選方法，可以減少在艱難梭菌感染檢測的延誤。但是這些快速檢測普遍存在靈敏度低和陽(yáng)性預測值率等缺點(diǎn)^[5]。因此，臨床上迫切需要一種快速靈敏的艱難梭菌檢測方法。

 

目前的有研究表明，利用分子學(xué)方法進(jìn)行艱難梭菌檢測更有效^[12,13]。 Peterson 等評價(jià)了real- time PCR檢測是利用引物以毒素B基因的一段保守區域為靶點(diǎn)。 由于所有產(chǎn)毒菌株都攜帶毒素B（有些缺少毒素A），這被視為是產(chǎn)毒菌株的很好的替代標記。

這個(gè)研究是分兩個(gè)階段進(jìn)行。第一階段是將送到實(shí)驗室的618個(gè)艱難梭菌檢測標本，進(jìn)行普通的EIA測驗與PCR測驗比較。與結合毒素測驗的厭氧培養的金標準比較，EIA的靈敏度為67%，精確度為92%，而PCR的靈敏度為94%，準確度為97%。在這個(gè)階段，調查者還設定了一套明確艱難梭菌相關(guān)性腹瀉診斷的標準，并發(fā)現幾乎所有真正的CDAD病例每天會(huì )有3次或者更多的排便。對符合該標準的采自病人的370個(gè)標本，PCR檢測的靈敏度比EIA的更高（93% vs. 73%）。real-time PCR和厭氧培養測定皆比酶免疫測定（EIA）更加靈敏(P<.01 to P<.05)。作者總結，與EIA相比，real-time PCR是一個(gè)更加靈敏，相對迅速的測驗，應該在臨床實(shí)踐中考慮替代用來(lái)檢測毒性艱難梭菌的酶免疫測定。

目前市場(chǎng)上推出的艱難梭菌快速分子檢測有BD GeneOhm real-time PCR test和Cepheid公司的GeneXpert C. difficile快速檢測方法等。Stamper等（2009）評價(jià)了BD GeneOhm real-time PCR test的檢測效果，引用的標準是商業(yè)化應用的CTA（Wampole C.difficile Toxin B test）。通過(guò)研究表明，GeneOhm的靈敏度為83.6% (95% CI: 74.3% to 92.9%) ，精確度為98.2% (96.8% to 99.6%)，PPV 和NPV分別為 89.5% (81.5% to 97.4%) 、97.1% (95.3% to 98.9%)。整個(gè)GeneOhm real-time PCR test大概需要3h，而一般CTA需要24-48h，厭氧培養的時(shí)間大約為5天。作者總結認為，GeneOhm是一個(gè)快速靈敏的C.difficile分子檢測方法^[14]。

而Cepheid公司推出的GeneXpert C. difficile快速分子檢測，具有更強大的優(yōu)勢。整個(gè)檢測過(guò)程僅需要30分鐘。與肉湯富集產(chǎn)毒培養進(jìn)行比較，其靈敏度為93.5%，精確度為94.0%。與現有的PCR檢測、細胞毒素測定、EIA等各種檢測方法比較，其具有高度的靈敏度。因此，相比之下，GeneXpert C. difficile檢測是一種更加快速、靈敏的檢測方法。

 

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